β-蒎烯合成酶（QH6）在大腸桿菌中的表達(dá)及其產(chǎn)β-蒎烯的研究

馮紅茹，楊建明，秦 利，咸 漠

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.中國科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所生物基材料重點實驗室，山東 青島 266101；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109）

β-蒎烯合成酶（QH6）在大腸桿菌中的表達(dá)及其產(chǎn)β-蒎烯的研究

馮紅茹1，2，楊建明2，3，秦 利1，咸 漠2

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.中國科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所生物基材料重點實驗室，山東 青島 266101；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109）

蒎烯是一種重要的平臺化合物，可以用來合成高密度燃料、精細(xì)化學(xué)品及材料。將來源于黃花蒿的β-蒎烯合成酶基因與外源雜合甲羥戊酸（MVA）途徑一起整合到BL21（DE3）中共表達(dá)，通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC- MS）和氣相色譜（GC）對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了定性及定量檢測。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，對影響發(fā)酵產(chǎn)β-蒎烯的因素（誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度和N源）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明：來自黃花蒿的蒎烯合酶可以在宿主細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，且能高效催化β-蒎烯的合成。通過對重組菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)條件：誘導(dǎo)溫度為28℃，IPTG濃度為0.1 mmol/L，最佳有機(jī)N源為MD牛肉粉。在此條件下，檢測出β-蒎烯產(chǎn)量達(dá)到22.89 mg/L，比優(yōu)化前（4.60 mg/L）提高了3.98倍。

β-蒎烯合成酶；大腸桿菌；親和層析；生物合成

蒎烯是一種重要的萜類化合物，在自然界中主要以2種形式存在：α-蒎烯和β-蒎烯。二者是一對同分異構(gòu)體，β-蒎烯有一雙鍵在環(huán)外，比α-蒎烯更易形成二聚體結(jié)構(gòu)，β-蒎烯二聚體的燃料性能略優(yōu)于α-蒎烯二聚體［1］。由于蒎烯二聚體的高能量密度和高燃燒凈熱值（能量密度0.938 g/cm3，燃燒凈熱值39.5 MJ/L），被廣泛應(yīng)用于高密度燃料的合成。除此之外，還廣泛應(yīng)用于藥理活性物、農(nóng)用及家用生物活性物、功能材料、香料、松油醇、芳香醇、乙酸松油酯、二氫松油醇和二氫月桂烯醇等的合成［2-3］。

目前，工業(yè)上獲得蒎烯的主要來源是采用高效精餾塔從脂松節(jié)油或粗硫酸鹽松節(jié)油中進(jìn)行分離提?。?-5］。這種方法存在對設(shè)備要求高、操作困難、能耗大和效率低等缺點，同時造成大量自然資源的浪費(fèi)。通過在工業(yè)微生物中構(gòu)建合成代謝路徑，以低成本的可再生生物質(zhì)為原料生產(chǎn)各種化學(xué)品，包括萜類化學(xué)品，可以有效地解決化學(xué)品的原料瓶頸問題。

目前，只有Yang等［6］對生物法合成α-蒎烯進(jìn)行了研究，α-蒎烯的產(chǎn)量最高達(dá)到了0.97 g/L。而Lu等［7］的研究檢測了黃花蒿的蒎烯合成酶（QH6）的體外酶反應(yīng)，在添加底物牻牛兒焦磷酸（GPP）的條件下產(chǎn)生了質(zhì)量比例為94∶6的β-蒎烯和α-蒎烯混合物。但并未對其直接進(jìn)行生物發(fā)酵獲得目的產(chǎn)物進(jìn)行研究。

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，將黃花蒿的蒎烯合成酶基因與實驗室構(gòu)建的生物體外高效甲羥戊酸（MVA）途徑共同整合到大腸桿菌中，通過生物發(fā)酵得到了β-蒎烯和α-蒎烯的混合物，并通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）及GC對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了定性及定量研究，以實現(xiàn)以葡萄糖為底物，經(jīng)大腸桿菌發(fā)酵獲得目的產(chǎn)物β-蒎烯。以期為微生物法合成蒎烯的工業(yè)化研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及材料

E.coli BL 21（DE3），Invitrogen公司；pACYCDuet-1質(zhì)粒，Novagen公司；含有β-蒎烯合成酶基因的質(zhì)粒pGH-QH6，上海捷瑞生物科技有限公司。

1.1.2 工具酶和試劑

Pyrobest DNA聚合酶、dNTP、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒，TaKaRa公司；Ni SephroseTM6×fast flow，GE Healthcare公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，F(xiàn)ermentas公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，Omega公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG），Biosharp公司；胰蛋白胨和酵母抽提物，Oxoid公司；α-蒎烯、β-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；牛肉粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；大豆蛋白胨，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨，天津大茂化學(xué)試劑廠；牛肉膏，Solarbio公司；牛肉浸膏，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；牛肉浸粉，阿拉丁公司；牛肉粉，Molecular Devices公司。所有試劑如無特殊說明均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10；LB液體培養(yǎng)基加入20 g/L的瓊脂粉即為LB固體培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 9.8 g、檸檬酸·H2O 2.1 g、檬酸鐵銨0.3 g、MD牛肉粉9 g、葡萄糖2 g、1 mL 1 000×微量元素（（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.37 g、ZnSO4·7H2O 0.29 g、H3BO42.47 g、CuSO4·5H2O 0.25 g、MnCl2·4H2O 1.58 g用蒸餾水定容至100 mL過濾除菌）、1 mol/L MgSO42 mL。并根據(jù)情況添加100 μg/mL的氨芐青霉素或34 μg/mL的氯霉素。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜連用儀，Agilent Technologies公司；SP6890型氣相色譜儀，山東魯南瑞宏有限公司；Mycycler PCR儀、PowerPac Basic核酸電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；Allegra X-22R型離心機(jī)，德國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 外源基因的克隆

黃花蒿的β-蒎烯合成酶基因QH6（GenBank登錄號AF276072.1）通過化學(xué)合成法合成，合成的基因片段被構(gòu)建到了pGH克隆載體上。為了將QH6基因克隆到表達(dá)載體上，合成的pGH-QH6帶有限制性內(nèi)切酶位點BglⅡ和XhoⅠ。

設(shè)計合成如下PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物：ATCGGGATCCGAACCGTCGTTCTGCTAACTA，反向引物：CGATGAGCTCTTAGATCGGGTTAACGAACA，其中正向引物和反向引物分別引入BamHⅠ和SacⅠ酶切位點（下劃線），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以大腸桿菌基因組為模板，PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性3 min；94℃ 變性30 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸2.5 min，循環(huán)30次；72℃ 延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 本研究中所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study

1.3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

以pGH-QH6為模板，以上述引物擴(kuò)增目的基因QH6，得到帶有特定酶切位點的基因片段。PCR產(chǎn)物和pACYDuet-1質(zhì)粒均采用BamH I和Sac I雙酶切，將純化后的DNA片段與線性化的pACYDuet-1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。菌液PCR篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定并測序。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pFHR-1（表1）。該載體用于單獨分析該基因的可溶性表達(dá)情況。

將pGH-QH6和pYJM27質(zhì)粒均采用Bgl II和Xho I雙酶切，對酶切產(chǎn)物QH6和pYJM27的大片段進(jìn)行膠回收，將純化后的2個線性片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。菌液PCR篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定并測序。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pFHR-2。由于pYJM27和pYJM14共同完成外源雜合甲羥戊酸（MVA）途徑的構(gòu)建，本文將pFHR-2和pYJM14兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化E.coli，從而構(gòu)建以葡萄糖為底物，經(jīng)MVA途徑合成β-蒎烯的新方法。

1.3.3 重組菌的蛋白表達(dá)及純化

將pFHR-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）獲得工程菌株，命名為FHR-1。將FHR-1接種于含有氯霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1%接種量（體積分?jǐn)?shù)）轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮的含有氯霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600約為0.6），加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后收集菌體。用5 mL磷酸緩沖液（PBS）（0.5 mol/L NaH2PO419 mL，0.5 mol/L Na2HPO481 mL、NaCl 2.93 g，pH 7.4）重懸菌體后，置于冰上超聲破碎，4℃、12 000 r/min離心10 min取部分上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測，剩余部分用Ni SephroseTM6×fast flow純化系統(tǒng)純化His-tag融合蛋白。

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)物定性檢測

pYJM14和pFHR-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）獲得工程菌株，命名為FHR-2。挑取單克隆到含有氯霉素和氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃活化過夜。按1%接種量轉(zhuǎn)接至500 mL厭氧瓶中（含100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基），30℃ 下誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。分別用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）及氣相色譜（GC）方法對產(chǎn)物進(jìn)行了定性和定量。

（1）GC-MS定性檢測發(fā)酵產(chǎn)物。

GC-MS檢測同樣采用頂空氣相色譜法測定。利用Ailgent氣相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序為40℃保持5 min，以20℃/min升至75℃，保持1 min；以20℃ /min升至245℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275℃；離子源溫度200℃；母離子m/z 285；激活電壓1.5 V；全掃描模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 10～600。樣品通過與蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖直接比對，進(jìn)行定性分析。

圖1 重組菌FHR-2中引入的用于合成蒎烯的MVA代謝途徑Fig.1 MVA pathway for pinene biosynthesis in strain FHR-2

（2）氣相色譜（GC）定量檢測發(fā)酵產(chǎn)物。

GC檢測采用頂空氣相色譜法測定［8］。收集1 mL密閉培養(yǎng)基頂部空間的氣體樣品，采用山東魯南瑞虹SP-6890型氣相色譜儀，色譜柱為HP--INNOWAX column（25 m×250 μm×0.2 μm），檢測器為FID檢測器；氣化室溫度200℃，柱室溫度升溫程序50℃ 保溫0.5 min，4℃/min升至70℃，20℃/min升至250℃，檢測器溫度200℃，載氣流速1 mL/min。用已知濃度的蒎烯繪制蒎烯標(biāo)準(zhǔn)曲線［6］，通過將檢測得到的峰面積引入標(biāo)準(zhǔn)曲線，對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定量。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

為進(jìn)一步提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，本研究對發(fā)酵過程進(jìn)行了單因素水平的篩選［9-10］。主要考察了4種因素（誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、N源組成和轉(zhuǎn)速）對生物發(fā)酵產(chǎn)β-蒎烯的影響規(guī)律。

（1）誘導(dǎo)溫度。

挑取單克隆于5 mL LB小瓶中培養(yǎng)活化過夜，按1%量接種于100 mL含有氯霉素和氨芐霉素的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，當(dāng)OD600=0.6～0.9，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG分別于不同溫度下（25、28、30、34和37℃）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在不同時間點取1 mL頂空氣體進(jìn)行GC測定。

（2）誘導(dǎo)劑（IPTG）濃度。

挑取單克隆于5 mL LB小瓶中培養(yǎng)活化過夜，按1%量接種于100 mL含有氯霉素和氨芐霉素的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，當(dāng)OD600= 0.6～0.9，加入不同濃度的IPTG（0.1、0.25、0.5和1 mmol/L）于28℃下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在不同時間點取1 mL頂空氣體進(jìn)行GC測定。

（3）N源。

考察7種不同廠家來源的有機(jī)氮對生物催化合成β-蒎烯產(chǎn)量的影響規(guī)律。取單克隆于5 mL LB小瓶中培養(yǎng)活化過夜，按1%量接種于100 mL含有氯霉素和氨芐霉素及不同N源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，當(dāng)OD600=0.6～0.9，加入0.5 mmol/L IPTG于30℃下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在不同時間點取1 mL頂空氣體進(jìn)行GC測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-蒎烯合成酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

為驗證外源基因是否在重組菌中正確且有效的表達(dá)，本研究將構(gòu)建兩個表達(dá)載體pFHR-1和pFHR-2。這2個質(zhì)粒都利用載體pACYDuet-1本身的啟動子進(jìn)行高拷貝的表達(dá)。

對構(gòu)建完成的含有質(zhì)粒pFHR-1和pFHR-2的重組大腸桿菌進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，均獲得了約800 bp的與預(yù)期大小相符的電泳條帶（圖2），純化后的重組質(zhì)粒分別經(jīng)過BamH I/Sac I和Bgl II/Xho I雙酶切后也得到大約為1.6 kb左右的片段，與預(yù)期相符。DNA測序分析顯示插入的 QH6基因（GenBank登錄號AF276072.1）和已報道的序列一致，二者的基因的同源性為100%，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 QH6蛋白的表達(dá)與驗證

構(gòu)建成功的表達(dá)載體pFHR-1經(jīng)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，得到重組菌FHR-1。由于載體pFHR-1含有His-tag，可以對表達(dá)蛋白進(jìn)行鎳柱純化，檢測其是否以可溶的形式在重組細(xì)胞中得到表達(dá)。雖然Lu等［7］也研究了該蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中的蛋白表達(dá)情況，但基于本次研究使用了不同的表達(dá)載體，且該基因還要與體外構(gòu)建的雜合MVA途徑共同構(gòu)建到宿主細(xì)胞中進(jìn)行生物發(fā)酵，仍需要檢測該蛋白是否在宿主細(xì)胞中得以正確表達(dá)。

圖2 PCR鑒定重組菌株中的β-蒎烯合成酶基因Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid containing QH6

圖3 β-蒎烯合成酶（QH6）的表達(dá)與純化Fig.3 Expression and purification of β-pinene synthase gene in recombinant E.coli

重組菌FHR-1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h，菌體超聲破碎后，離心去除細(xì)胞碎片，上層裂解液進(jìn)行SDSPAGE檢測，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：蛋白經(jīng)Ni柱純化之后，SDS-PAGE檢測結(jié)果在相對分子質(zhì)量約為6.0×104處出現(xiàn)1條特異帶，與預(yù)期的His-tag融合蛋白理論大小數(shù)值相符。說明β-蒎烯合成酶基因QH6在大腸桿菌BL21（DE3）中以可溶性的形式得到了正確表達(dá)。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物定性檢測

2.3.1 GC-MS定性檢測發(fā)酵產(chǎn)物

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pFHR-2和YJM14共轉(zhuǎn)到感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，得到重組菌FHR-2。經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600= 0.4～0.6時，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，30℃培養(yǎng)24 h后，抽取1mL頂空氣體進(jìn)行GC-MS檢測。GC檢測結(jié)果表明：混合氣體中同時含有α-蒎烯和β-蒎烯。通過質(zhì)譜分析進(jìn)一步確定了產(chǎn)物是α-蒎烯和β-蒎烯的混合物。

2.3.2 GC定量檢測發(fā)酵產(chǎn)物

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pFHR-2和YJM14共轉(zhuǎn)到感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，得到重組菌FHR-2。經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600= 0.4～0.6時，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，30℃培養(yǎng)24 h后，抽取1 mL頂空氣體測定β-蒎烯的產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：β-蒎烯合成酶既可以催化產(chǎn)生β-蒎烯還可以催化產(chǎn)生一定量的α-蒎烯，產(chǎn)物α-蒎烯和β-蒎烯的質(zhì)量濃度分別為0.32、4.60 mg/L；其質(zhì)量比為6.5∶93.5，與Lu等［7］的研究結(jié)果6∶94存在略微差異。分析原因可能是發(fā)酵過程及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性影響產(chǎn)物的合成，也有可能是檢測過程中出現(xiàn)的誤差所致。

圖4 樣品GC檢測結(jié)果Fig.4 GC analysis of samples

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 誘導(dǎo)溫度對β-蒎烯產(chǎn)量的影響

低的誘導(dǎo)溫度可以增加重組酶的可溶性表達(dá)，進(jìn)而增加其在工程菌細(xì)胞體內(nèi)的活性［11-12］。然而低的誘導(dǎo)溫度勢必會影響菌體的正常生長，從而影響目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此，最佳誘導(dǎo)溫度的控制是酶的表達(dá)、細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成的最佳平衡［10］。為提高目的產(chǎn)物β-蒎烯的產(chǎn)量，考察不同的誘導(dǎo)溫度（25、28、30、34和37℃）對產(chǎn)物的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 誘導(dǎo)溫度對工程菌FHR-2產(chǎn)β-蒎烯的影響Fig.5 Effects of induction temperature on β-pinene production by FHR-2

由圖5可知：隨著誘導(dǎo)時間的延長，不同誘導(dǎo)溫度下的β-蒎烯產(chǎn)量都有一個逐漸上升后又有所下降的趨勢。而隨著誘導(dǎo)溫度的升高，β-蒎烯的產(chǎn)量逐漸升高，在28℃時達(dá)到一個峰值，然后逐漸降低。這可能是由于搖瓶的氣密性不好和中間取樣造成膠塞漏氣等原因造成。在28℃誘導(dǎo)溫度下，β-蒎烯的產(chǎn)物質(zhì)量濃度最高可達(dá)5.01 mg/L，是30℃ 時最高產(chǎn)量（4.12 mg/L）的1.22倍。由此可知發(fā)酵最適誘導(dǎo)溫度為28℃。

2.4.2 誘導(dǎo)劑（IPTG）濃度對β-蒎烯產(chǎn)量的影響

外源基因的過量表達(dá)通常會增加工程菌的代謝負(fù)擔(dān)，從而影響細(xì)胞的生長速率、細(xì)胞濃度、產(chǎn)物水平及質(zhì)粒的穩(wěn)定性［13-14］。通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度可以改善外源基因的表達(dá)對細(xì)胞代謝的影響?？疾觳煌T導(dǎo)劑IPTG濃度（0.05、0.1、0.25、0.5和1 mmol/L）對工程菌β-蒎烯產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知：隨著誘導(dǎo)劑濃度的升高，β-蒎烯產(chǎn)量有一個先上升后下降的趨勢。誘導(dǎo)劑濃度低于0.5 mmol/L時，β-蒎烯的產(chǎn)量隨誘導(dǎo)時間的延長逐漸升高，最后又有所降低。在誘導(dǎo)劑濃度為1 mmol/L時，蒎烯產(chǎn)量極低而且沒有明顯升高的趨勢，可能是因為：高濃度誘導(dǎo)劑對于載體中重組酶的過表達(dá)導(dǎo)致了代謝負(fù)擔(dān)，使得代謝流不利于目標(biāo)產(chǎn)物的合成；同時高表達(dá)量載體對蛋白表達(dá)有利，卻不一定有利于終產(chǎn)物β-蒎烯的合成。在28℃誘導(dǎo)溫度下，IPTG濃度為0.1 mmol/L時，β-蒎烯的產(chǎn)物質(zhì)量濃度最高可達(dá)到18.933 mg/L。而0.05、0.25、0.5和1 mmol/L的最高產(chǎn)物質(zhì)量濃度分別為13.953、5.78、4.12和1.184 mg/L。由此可知，IPTG最適誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L。

圖6 IPTG濃度對工程菌FHR-2產(chǎn)β-蒎烯的影響Fig.6 Effects of inducer concentration on β-pinene production by FHR-2

2.4.3 N源對β-蒎烯產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基的N源種類在提高微生物發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率方面發(fā)揮重要的作用［15］?？疾?種不同廠家來源的有機(jī)N源對生物催化合成β-蒎烯產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖7。除培養(yǎng)基中N源不同外，其他組分與前文一致。由圖7可知：在28℃誘導(dǎo)溫度下，IPTG濃度為0.1 mmol/L時，來自于MD公司的牛肉粉效果最好，β-蒎烯產(chǎn)量為22.89 mg/L。該結(jié)果比 Bokinsky等［16］得到的蒎烯產(chǎn)量（1.7±0.6）mg/L提高了12.46倍。

根據(jù)以上發(fā)酵條件優(yōu)化獲得的數(shù)據(jù)，不難看出微生物發(fā)酵生產(chǎn)β-蒎烯的最適培養(yǎng)條件是：誘導(dǎo)溫度為28℃，IPTG濃度為0.1 mmol/L，最佳有機(jī)N源為MD牛肉粉。

圖7 不同N源對工程菌FHR-2產(chǎn)β-蒎烯的影響Fig.7 Effects of different organic nitrogen source on β-pinene production by FHR-2

3 結(jié)論

將β-蒎烯合成酶與外源雜合的甲羥戊酸（MVA）一起整合到大腸桿菌BL21（DE3）中，通過對重組菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)條件：誘導(dǎo)溫度為28℃，IPTG濃度為0.1 mmol/L，最佳有機(jī)N源為MD牛肉粉，在此條件下，檢測出β-蒎烯產(chǎn)量達(dá)到22.89 mg/L，比優(yōu)化前（4.60 mg/L）提高了3.98倍。從合成生物學(xué)的角度來分析本研究的實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù)可知：對于構(gòu)建多酶催化的復(fù)雜代謝途徑而言，有必要通過發(fā)酵條件優(yōu)化等手段來調(diào)整各種酶的表達(dá)量與活力，使得代謝流更有利于目標(biāo)產(chǎn)物合成。此外，本研究利用代謝工程的手段改造大腸桿菌，成功地在大腸桿菌體內(nèi)構(gòu)建了一條β-蒎烯合成途徑，為利用MVA途徑生產(chǎn)生物基化學(xué)品的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

［1］Meylemans H A，Quintana R L，Harvey B G.Efficient conversion of pure and mixed terpene feedstocks to high density fuels［J］. Fuel，2012，97：560-568.

［2］Harvey B G，Wright M E，Quintana R L.High-density renewable fuels based on the selective dimerization of pinenes［J］.Energy Fuels，2009，24（1）：267-273.

［3］Bokinsky G，Pamela P P，Anthe G.Synthesis of three advanced biofuels from ionic liquid-pretreated switchgrass using engineered Escherichia coli［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（50）：19949-19954.

［4］Behr A，Johnen L.Myrcene as a natural base chemical in sustainable chemistry：a critical review［J］.Chem Sus Chem，2009，2（12）：1072-1095.

［5］欒國顏，閻麗萍，高維平.松節(jié)油中提取α-蒎烯與β-蒎烯的分離研究［J］.吉林化工學(xué)院學(xué)報，1998，15（2）：11-16.

［6］Yang J M，Nie Q J，Ren M，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis of alpha-pinene［J］.Biotech Biofuels，2013.doi：10.1186/1754-6834-6-60.［7］Lu S，Xu R，Jia J W，et al.Cloning and functional characterization of a β-pinene synthase from Artemisia annua that shows a circadian pattern of expression［J］.Plant Physiol，2002，130（1）：477-486.

［8］Kolb B.Headspace sampling with capillary columns［J］.J Chromatogr A，1999，842（1）：163-205.

［9］Jones K L，Kim S W，Keasling J.Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic engineering of bacteria［J］.Metab Eng，2000，2（4）：328-338.

［10］Harcum S W，Bentley W E.Heat-shock and stringent responses have overlapping protease activity in Escherichia coli［J］.Appl Biochem Biotech，1999，80（1）：23-37.

［11］Sanchez D G N，Salvador V.Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies［J］.FEBS Lett，2006，580（27）：6471-6476.

［12］Hunke S，Betton J M.Temperature effect on inclusion body formation and stress response in the periplasm of Escherichia coli［J］.Mol Microbiol，2003，50（5）：1579-1589.

［13］Bentley W E，Mirjalili N，Aandersen D C，et al.Plasmid-encoded protein：the principal factor in the"metabolic burden"-associated with recombinant bacteria［J］.Biotechnol Bioeng，1990，35（7）：668-681.

［14］Glick B R.Metabolic load and heterologous gene expression［J］. Biotechnol Adv，1995，13（2）：247-261.

［15］Torija M J，Beltran G，Novo M，et al.Effect of the nitrogen source on the fatty acid composition of Saccharomyces cerevisiae［J］.Food Microbiol，2003，20（2）：255-258.

［16］Bokinsky G，Peralta-Yahya P P，George A，et al.Synthesis of three advanced biofuels from ionic liquid-pretreated switchgrass using engineered Escherichia coli［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（50）：19949-19954.

（責(zé)任編輯 荀志金）

Expression of β-pinene synthase（QH6）in Escherichia coli for the biosynthesis of β-pinene

FENG Hongru1，2，YANG Jianming2，3，QIN Li1，XIAN Mo2
（1.College of Bioscience and Biotechnology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；2.Key Laboratory of Bio-based Materials，Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266101，China；3.College of Life and Sciences，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

Pinene is an important natural product that is widely used in high-density renewable fuels and fine chemicals.The Artemisia annua β-pinene synthase gene（QH6）was successfully assembled in Escherichia coli BL21（DE3）with the heterologous hybrid mevalonate（MVA）pathway.Pinene was quantitatively analyzed and characterized by gas chromatography（GC）and GC-mass spectrometry（MS）. The influences of induction temperature，inducer concentration，and nitrogen on production of β-pinene were studied.After shake-flask fermentation，β-pinene productivity of the engineered strain was 4.60 mg/L.Under the optimum conditions of induction temperature 28℃，inducer（IPTG）concentration 0.1 mmol/L，and beef extract powder（MDbio Inc.），the β-pinene yield was up to 22.89 mg/L，3.98 times higher than that before optimization.

β-pinene synthase；E.coli；affinity chromatography；biosynthesis

Q851

A

1672-3678（2015）01-0028-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.006

2013-09-11

國家自然科學(xué)基金（21376255）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（SS2013AA050703-2）；青島科技發(fā)展計劃（12-1-4-9-（3）-jch）

馮紅茹（1989—），女，河北衡水人，碩士研究生，研究方向：生物化工；楊建明（聯(lián)系人），教授，E-mail：yjming888@126.com