黑曲霉（Aspergillus niger）發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的pH調(diào)控策略

邢亞梅，陳 勇，應(yīng)漢杰

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 211800）

黑曲霉（Aspergillus niger）發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的pH調(diào)控策略

邢亞梅，陳 勇，應(yīng)漢杰

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 211800）

為了提高黑曲霉（Aspergillus niger）D08生產(chǎn)木聚糖酶的能力，考察了不同pH條件對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木聚糖酶發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)的最適pH與木聚糖酶合成的最適pH不同，分別為3.5和4.5。由此針對(duì)性地提出了兩階段pH控制策略：在30 h內(nèi)控制pH為3.5；30 h后pH控制為4.5。結(jié)果表明：分階段pH調(diào)控策略的實(shí)施進(jìn)一步提高了菌體合成木聚糖酶的能力，木聚糖酶比酶活（2 223.38 U/mL）和生產(chǎn)強(qiáng)度（26.47 U/（mL·h））分別比恒定pH 4.5時(shí)提高了14.3%和30.6%。該工藝對(duì)提高木聚糖酶活力具有一定的指導(dǎo)意義，為后續(xù)研究和生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

pH調(diào)控；木聚糖酶；黑曲霉

植物纖維是自然界中儲(chǔ)存量最大、最豐富，也是最廉價(jià)的一類可再生資源，其中半纖維素約占15%～30%［1］。作為半纖維素的主要組成成分，木聚糖廣泛分布于高等植物的細(xì)胞壁中，是自然界中存儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素的多糖［2］。木聚糖酶是一類可以將木聚糖降解成低聚糖和木糖的水解酶類，主要由β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶（EC3.2.1.8）和β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）組成，其功能分別是切斷木聚糖主鏈中的木糖苷鍵以及將寡聚糖進(jìn)一步降解為單體木糖［3］。

同時(shí)，木聚糖酶作為一種工業(yè)酶制劑，在諸多領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。在植物性飼料中，添加木聚糖酶可以降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子非淀粉多糖（NSPS），從而提高禽畜對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率［4］。在食品行業(yè)，木聚糖酶可以將半纖維素含量較高的農(nóng)業(yè)廢棄物降解成為低聚木糖［5］。在生物能源轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，木聚糖酶可與纖維素酶系協(xié)同作用，將植物纖維降解為戊糖和己糖，并以其作為發(fā)酵底物，進(jìn)一步通過(guò)微生物生產(chǎn)乙醇［6-7］。在生物制漿漂白領(lǐng)域，木聚糖酶可以作為生物漂白助劑應(yīng)用于造紙工業(yè)［8］。

目前，木聚糖酶主要依靠微生物發(fā)酵法獲得，現(xiàn)已知能夠合成木聚糖酶的微生物主要涉及真菌、鏈霉菌、細(xì)菌和酵母等［1］。曲霉屬菌株（Aspergillus sp.）是生產(chǎn)木聚糖酶的優(yōu)良菌株，成為國(guó)內(nèi)外木聚糖酶生產(chǎn)研究的重點(diǎn)［9］。為了提高曲霉屬產(chǎn)木聚糖酶的能力，我國(guó)科研工作者已在菌種選育［10-11］、發(fā)酵優(yōu)化［12-14］、酶學(xué)性質(zhì)［10，15］等方面開(kāi)展了大量的研究工作。在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，pH、溫度均是影響微生物合成木聚糖酶的重要因素。針對(duì)菌體生長(zhǎng)和木聚糖酶合成的最適溫度不一致這一特性，Yuan等［16］提出了一種分階段的溫度調(diào)控策略，使木聚糖酶的生產(chǎn)強(qiáng)度得到提高。受上述研究的啟發(fā)，本文嘗試研究pH對(duì)木聚糖酶發(fā)酵過(guò)程不同階段的影響，并以此為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)新的pH控制策略，旨在提高微生物合成木聚糖酶的能力。

本文著重考察pH對(duì)黑曲霉（Aspergillus niger）D08菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)木聚糖酶能力的影響，并結(jié)合發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析，導(dǎo)向性地采用分階段pH調(diào)控策略，以初步實(shí)現(xiàn)木聚糖酶的高效生產(chǎn)，旨在提高微生物合成木聚糖酶的能力。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）D08，由南京工業(yè)大學(xué)國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室誘變篩選并保藏。

1.2 主要試劑

山櫸木木聚糖、3，5-二硝基水楊酸（DNS）（Sigma公司），馬鈴薯、麩皮粉和玉米芯粉均購(gòu)自南京近郊（麩皮粉和玉米芯粉粉碎后過(guò)0.177 mm篩使用），其他試劑為化學(xué)純或分析純?cè)噭?/p>

1.3 主要儀器

WFJ7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；HVE-50型高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司；PYX-DHS-40×50-BS型隔水式電熱恒溫箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；ZQZY-C型震蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；BIOQ-PH12高通量生物反應(yīng)器，匯合堂生物工程設(shè)備（上海）有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基（g/L）：麩皮50、蔗糖10。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：麩皮40、玉米芯28.1、NaNO34.2、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、吐溫-80 0.5。

以上培養(yǎng)基在121℃、105Pa條件滅菌15 min，待用。

1.5 培養(yǎng)方法

1）菌種活化 將保藏菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

2）菌種培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子以3%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接入12通道的1 L生物反應(yīng)器中，裝液量為400 mL，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，通氣量為0.8 vvm（1個(gè)vvm表示每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值），溫度30℃，以NaOH（1 mol/L）和稀HCl（1 mol/L）調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程的pH。

1.6 粗酶液的制備

發(fā)酵液用冷凍離心機(jī)5 000 r/min離心10 min，吸取上清液，即粗酶液。

1.7 生物量的測(cè)定

過(guò)濾法收集發(fā)酵培養(yǎng)物中的菌絲球，洗滌數(shù)次后移至干燥箱中，80℃恒溫干燥24 h，稱質(zhì)量。

1.8 木聚糖酶活的測(cè)定

取適當(dāng)稀釋的粗酶液50 μL，加入0.45 mL的0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH 4.8）及 1 mL、1.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的木聚糖底物，在50℃條件下反應(yīng)30 min。木糖生成量的測(cè)定參照文獻(xiàn)［17］進(jìn)行。

酶活定義（U）：在50℃條件下反應(yīng)30 min，每分鐘降解底物生成1 μmol木糖所需的酶量。

1.9 菌體比速率的計(jì)算

2 結(jié)果與討論

2.1 未控制pH條件下Aspergillus niger D08發(fā)酵合成木聚糖酶的特性

在1 L高通量生物反應(yīng)器中考察初始pH為6.0時(shí)菌體的發(fā)酵特征，結(jié)果如圖1所示。

圖1 初始pH為6.0時(shí)Aspergillus niger D08在發(fā)酵過(guò)程中pH、木聚糖比酶酶活及菌體生長(zhǎng)的變化情況Fig.1 Time course of pH，xylanase activity and biomassin fermentation of Aspergillus niger D08 at initial pH of 6.0

由圖1可知：菌體生長(zhǎng)經(jīng)過(guò)短暫的延滯期后很快進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵至48 h菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。24 h內(nèi)菌株產(chǎn)木聚糖酶的能力較弱，24 h后迅速產(chǎn)酶，96 h時(shí)比酶活達(dá)到最大值（1 621.22 U/mL），隨后趨于穩(wěn)定。木聚糖酶活力的增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯滯后于菌體生長(zhǎng)，這再一次證明了黑曲霉合成木聚糖酶的過(guò)程屬于部分生長(zhǎng)耦聯(lián)型［18］。

隨后觀察菌株發(fā)酵過(guò)程中pH的變化情況，可發(fā)現(xiàn)pH呈現(xiàn)先降低，后升高的趨勢(shì)：在36 h內(nèi)，pH由6.0下降至2.2，而后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，pH緩慢上升至4左右。這一現(xiàn)象可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵前期，菌體快速生長(zhǎng)的過(guò)程中產(chǎn)生大量有機(jī)酸［16］，導(dǎo)致pH降低；隨著細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，代謝產(chǎn)物積累，代謝活動(dòng)降低，菌體細(xì)胞呼吸作用減弱，使得發(fā)酵體系中pH上升。

pH影響培養(yǎng)基中部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的解離狀態(tài)、菌株細(xì)胞膜的生理功能及細(xì)胞內(nèi)各種酶的活性［19］，進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。

2.2 不同pH條件下Aspergillus niger D08發(fā)酵合成木聚糖酶的特性

為了進(jìn)一步了解pH對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶能力的影響，考察不同pH條件下菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶情況結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同pH對(duì)Aspergillus niger D08生長(zhǎng)及產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.2 Effects of different pH on the cell growth and xylanase production of Aspergillus niger D08

由圖2可知：pH的升高致使菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成產(chǎn)生延遲現(xiàn)象；同時(shí)，隨著pH的升高，菌體的生長(zhǎng)速率及生物量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，然而木聚糖酶的活性則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在pH為4.5時(shí)最高，在pH為5.0時(shí)最低。當(dāng)pH為3.5，發(fā)酵48 h時(shí)生物量達(dá)到最大值（10.45 g/L），之后細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期；木聚糖酶的合成滯后于菌體生長(zhǎng)，在發(fā)酵至72 h時(shí)達(dá)到最大比酶活（1 487.36 U/mL）。當(dāng)pH高于3.5，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生物量下降，木聚糖酶比酶活達(dá)到最大值的時(shí)間相應(yīng)向后推遲。pH 4.5條件下，木聚糖酶比酶活最高（1 945.46 U/mL）；但菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵96 h木聚糖酶酶活才達(dá)到最大值，相比pH 3.5條件下推遲了24 h。當(dāng)pH升至5.0時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生物量下降，合成木聚糖酶的能力也下降。

由圖2分析可得，相對(duì)較高的pH更有利于菌體合成木聚糖酶，但是過(guò)高的pH又不利于菌體生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步研究不同pH條件對(duì)菌體生長(zhǎng)及合成木聚糖酶的影響，考察了不同pH條件下細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和木聚糖酶比合成速率的動(dòng)力學(xué)過(guò)程曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。由圖3和圖4可知：pH 3.5時(shí)細(xì)胞最大比生長(zhǎng)速率為0.22 h-1，菌體生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期［20］（比生長(zhǎng)速率小于0.02 h-1）僅用了30 h，相比pH 4.5時(shí)縮短了34 h。當(dāng)pH由3.5升至4.5，菌體合成木聚糖酶的最高比速率逐漸增大，在pH 4.5時(shí)達(dá)到最大（6.90 U/（mg·h）），但其木聚糖酶的比合成速率達(dá)到峰值的時(shí)間相比pH 3.5條件下推遲了24 h。當(dāng)pH升至5.0時(shí)，菌體比生長(zhǎng)速率，木聚糖酶比合成速率均偏低。以上結(jié)果表明，當(dāng)pH控制為3.5時(shí)最適合菌體生長(zhǎng)，而pH控制為4.5時(shí)最適合木聚糖酶的合成。

圖3 pH對(duì)Aspergillus niger D08的比生長(zhǎng)速率的影響Fig.3 Effects of pH on specific cell growth rate in Aspergillus niger D08

2.3 Aspergillus niger D08發(fā)酵合成木聚糖過(guò)程中分階段pH控制策略的確定及驗(yàn)證

雖然pH對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成均有顯著影響，但菌體在生長(zhǎng)階段和產(chǎn)酶階段的最適pH不同，pH 3.5最適合菌體生長(zhǎng)，pH 4.5最適合木聚糖酶的合成，而在pH 4.5條件下菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成均表現(xiàn)出明顯的延遲現(xiàn)象，木聚糖酶酶活達(dá)到最高值的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。為了進(jìn)一步提高木聚糖酶的生產(chǎn)水平，針對(duì)性提出兩階段pH控制策略：發(fā)酵0～30 h，控制pH為3.5，以縮短細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期并促進(jìn)菌體生長(zhǎng)；30 h至發(fā)酵結(jié)束控制pH為4.5，利于細(xì)胞合成木聚糖酶，從而提高木聚糖酶的活力和生產(chǎn)強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 pH對(duì)Aspergillus niger D08合成木聚糖酶的比合成速率的影響Fig.4 Effects of pH on specific xylanase formation rate in Aspergillus niger D08

圖5 分階段控制pH對(duì)Aspergillus niger D08產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of pH shift operation on xylanase production and cell growth of Aspergillus niger D08

由圖5可知：采用分階段pH調(diào)控策略，顯著提高了菌株合成木聚糖酶的能力。在兩階段pH調(diào)控模式下，在48 h時(shí)，菌體達(dá)到生物量最大值，比恒定pH 4.5模式下提前24 h；最終，木聚糖酶比酶活（2 223.38 U/mL）和生產(chǎn)強(qiáng)度（26.47 U/（mL·h））比恒定pH 4.5模式下分別提高了14.3%和30.6%（表1）。

表1 兩階段pH控制策略與恒定pH 4.5模式下發(fā)酵參數(shù)Table 1 Fermentation properties of xylanase fermention in constant pH 4.5 and in pH control strategy

3 結(jié)論

本文詳細(xì)分析了木聚糖酶發(fā)酵過(guò)程中pH對(duì)Aspergillus niger D08菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)木聚糖酶能力的影響，結(jié)果表明：菌體生長(zhǎng)的最適pH與木聚糖酶合成的最適pH不同，分別為3.5和4.5。在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步提高木聚糖酶的生產(chǎn)效率，針對(duì)性地提出了兩階段pH調(diào)控策略：0～30 h控制pH為3.5，30 h后控制pH為4.5。通過(guò)該策略，木聚糖酶比酶活和生產(chǎn)強(qiáng)度比恒定pH 4.5模式下分別提高了14.3%和30.6%。

基于兩階段pH控制策略，Aspergillus niger D08合成木聚糖酶的能力顯著提高，為后續(xù)研究酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及酶分子的定向改造奠定了基礎(chǔ)，并有利于木聚糖酶的規(guī)模化生產(chǎn)應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Two-stage pH control strategy for xylanase production by Aspergillus niger D08

XING Yamei，CHEN Yong，YING Hanjie
（National Engineering Technique Research Center for Biotechnology，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

In order to improve xylanase production of Aspergillus niger D08，effects of pH on cell growth and xylanase production were investigated.The optimum pH for cell growth was 3.5，while that for xylanase production was 4.5.Accordingly，a two-stage pH control strategy was as follows：pH was controlled at 3.5 for the first 30 h，and then raised to 4.5 for the remaining time.With this strategy，the maximal xylanase activity and productivity ofxylanase reached 2 223.38 U/mL and 26.47 U/（mL·h），respectively，which were 14.3%and 30.6%higher than those in the single pH（pH 4.5）controlled model.This pH control strategy offers a promising guideline for enhancing the production of xylanase by Aspergillus niger D08，thus making a good foundation to further research and production of xylanase.

pH control；xylanase；Aspergillus niger

Q815

A

1672-3678（2015）01-0023-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.005

2013-12-30

國(guó)家杰出青年基金（21025625）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA021203）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAI44G01）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上基金（21376118）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（21106070）；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新發(fā)展計(jì)劃（PCSIRT）；江蘇自然科學(xué)基金（SBK20150207）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（PAPD）

邢亞梅（1988—），女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向：生物催化；陳 勇（聯(lián)系人），副研究員，E-mail：chenyong1982@ njtech.edu.cn