預(yù)處理沙柳酶解液脫毒及其丁醇發(fā)酵

林增祥，李榮秀，劉 莉，沈兆兵，史吉平

（1.中國(guó)科學(xué)院 上海高等研究院可持續(xù)技術(shù)研究中心，上海 201210；2.上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生物制造實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

預(yù)處理沙柳酶解液脫毒及其丁醇發(fā)酵

林增祥1，2，李榮秀2，劉 莉1，沈兆兵1，史吉平1

（1.中國(guó)科學(xué)院 上海高等研究院可持續(xù)技術(shù)研究中心，上海 201210；2.上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生物制造實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

為了提高沙柳原料的丁醇發(fā)酵效果，考察沙柳原料經(jīng)過(guò)蒸爆、超微粉碎+稀酸和超微粉碎+稀堿預(yù)處理后補(bǔ)料酶解的效果，優(yōu)化了沙柳酶解液活性炭脫毒工藝參數(shù)，并對(duì)經(jīng)過(guò)脫毒處理的酶解液進(jìn)行了丁醇發(fā)酵研究，結(jié)果表明：預(yù)處理沙柳原料酶解底物質(zhì)量濃度為200 g/mL時(shí)，3種預(yù)處理方法中蒸爆處理法水解效果最好，每克底物的濾紙酶酶加量15 U，酶解96 h后，酶解液總糖質(zhì)量濃度達(dá)到57 g/L?；钚蕴棵摱咎幚淼淖顑?yōu)條件：pH 4.8，碳加量4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、溫度70℃、1 h，該條件下的沙柳水解液脫色率達(dá)到97.4%、糖損失率3.1%。3種預(yù)處理沙柳原料的酶解液經(jīng)活性炭脫毒后都可以被丁醇梭菌正常利用發(fā)酵產(chǎn)丁醇，發(fā)酵液總?cè)軇ˋBE）質(zhì)量濃度約為14 g/L。

沙柳；預(yù)處理；補(bǔ)料酶解；發(fā)酵；丁醇

沙柳是我國(guó)北方一種常見的沙生灌木，具有良好的防風(fēng)固沙、保持水土的作用，廣泛生長(zhǎng)在內(nèi)蒙古、青海、甘肅等地。目前，平茬下來(lái)的枝條大部分未被充分利用，少部分用來(lái)造紙及生產(chǎn)人造板［1］。

沙柳可以作為生產(chǎn)丁醇等化工產(chǎn)品的潛在木質(zhì)纖維素原料，其生物轉(zhuǎn)化過(guò)程主要有3個(gè)環(huán)節(jié)。首先是對(duì)沙柳進(jìn)行預(yù)處理，其次是將原料中的纖維素、半纖維素水解為可發(fā)酵的糖，最后就是將水解糖液通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)丁醇。近年來(lái)，研究應(yīng)用較多的預(yù)處理方法主要有蒸氣爆破預(yù)處理、稀酸預(yù)處理和稀堿預(yù)處理等。原料經(jīng)過(guò)預(yù)處理可以實(shí)現(xiàn)原料的組分分離和結(jié)構(gòu)改變，從而進(jìn)一步提高原料的酶水解效率。雖然科研人員對(duì)木質(zhì)纖維素的預(yù)處理方法進(jìn)行了大量研究［2-9］，但是針對(duì)沙柳酶解液進(jìn)行丁醇發(fā)酵的研究還比較少。

用蒸爆、稀酸和稀堿等物理化學(xué)法預(yù)處理木質(zhì)纖維原料可以提高原料水解率，但植物纖維原料在預(yù)處理過(guò)程中部分半纖維素和木質(zhì)素會(huì)降解，原料中的色素、單寧、果膠等成分在該過(guò)程中被降解和溶解，主要降解產(chǎn)物有機(jī)酸、醛類和酚類等物質(zhì)使原料顏色呈黑褐色，并且這些降解產(chǎn)物會(huì)嚴(yán)重影響或抑制微生物的生長(zhǎng)代謝，甚至引起微生物死亡。所以，為提高發(fā)酵效果，對(duì)水解液進(jìn)行脫色和脫毒處理很有必要。在食品工業(yè)領(lǐng)域，活性炭吸附法廣泛應(yīng)用于糖液的脫色提純，且脫色效果好［10-14］。

本研究對(duì)沙柳原料進(jìn)行蒸爆、超微粉碎+稀酸和超微粉碎+稀堿3種預(yù)處理，通過(guò)補(bǔ)料酶解的方法獲得較高濃度的水解液，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)丁醇的效果進(jìn)行考察，以期為沙柳原料的低成本、高效率的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程提供參考［15］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原料：沙柳（產(chǎn)地內(nèi)蒙古鄂爾多斯，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.5%）。

纖維素酶制劑：纖維素酶（上海尤特爾生化有限公司，以濾紙酶活計(jì)，346 FPU/g）。

丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）8016，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

原料預(yù)處理設(shè)備：QBS-80型汽爆工藝實(shí)驗(yàn)臺(tái)（河南鶴壁市正道重機(jī)集團(tuán)有限公司）；超微氣流粉碎機(jī)（上海高等研究院微納粉體設(shè)備研發(fā)實(shí)驗(yàn)室）。

活性炭：糖用脫色活性炭HLF（溧陽(yáng)市華龍活性炭廠）。

1.2 沙柳原料預(yù)處理

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究工作，確定沙柳原料的蒸氣爆破預(yù)處理、超微粉碎+稀酸預(yù)處理、超微粉碎+稀堿預(yù)處理的最優(yōu)條件［16-18］：1）超微粉碎+稀堿處理超微粉碎原料粒度（15 μm）、NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%、95℃、45 min，原料預(yù)處理后用稀H2SO4調(diào)pH至中性，過(guò)濾，取濾渣備用。2）超微粉碎+稀酸處理超微粉碎原料粒度（15 μm）、固液比1∶12（g/mL）、溫度160℃、H2SO4體積分?jǐn)?shù)0.5%、時(shí)間20 min，原料預(yù)處理后用稀NaOH調(diào)pH至中性，過(guò)濾，取濾渣備用。3）蒸氣爆破預(yù)處理蒸爆處理?xiàng)l件為壓力3.5 MPa、維壓時(shí)間300 s。

1.3 預(yù)處理沙柳原料補(bǔ)料酶解

稱取經(jīng)蒸氣爆破預(yù)處理、超微粉碎+稀酸預(yù)處理、超微粉碎+稀堿預(yù)處理的沙柳原料12.0 g（干質(zhì)量），裝入三角搖瓶，再加入0.05 mol/L檸檬酸緩沖液，酶解體系初始底物質(zhì)量濃度為120 g/mL，每克底物酶加量20 FPU，酶解糖化條件為pH 4.8、恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速250 r/min、溫度50℃，酶解24 h后補(bǔ)料，最終底物質(zhì)量濃度為200 g/mL，蒸爆處理最終酶加量為每克底物15 FPU，超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀堿處理最終酶加量為每克底物20 FPU。

1.4 沙柳酶解液活性炭脫毒條件優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)沙柳酶解液脫毒工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選擇pH、溫度、時(shí)間和碳加量4個(gè)考察因素，用正交試驗(yàn)表L9（34）設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)的因素水平如表1所示。

表1 活性炭處理沙柳酶解液正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design of activated carbon treated Salix hydrolysate

脫色率計(jì)算見式（1），糖損失率計(jì)算見式（2）。

式中：A為420 nm沙柳水解液吸光度值；m為沙柳水解液中葡萄糖與木糖質(zhì)量之和。

活性炭脫毒的酶解液為沙柳原料蒸爆處理水解液，吸光度A420=2.63，葡萄糖質(zhì)量濃度25.3 g/L。

1.5 脫毒酶解液丁醇發(fā)酵

取50 mL經(jīng)活性炭脫毒處理的沙柳酶解液，裝入100 mL三角瓶中，添加玉米漿4.0 g/L，接入丁醇菌種，37℃靜置發(fā)酵72 h。待發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心，取上清液分析檢測(cè)。

1.6 分析方法

水解液中糖的分析采用HPLC法：液相色譜儀Shimadzu 20A，色譜條件參照文獻(xiàn)［19］。

發(fā)酵液中溶劑和有機(jī)酸的分析采用GC法：氣相色譜儀Shimadzu 2010 Plus，色譜條件參照文獻(xiàn)［19］。

吸光度測(cè)定采用分光光度計(jì)，420 nm處測(cè)吸光度A420。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙柳水解液活性炭脫毒正交試驗(yàn)結(jié)果

沙柳水解液活性炭脫毒正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，沙柳水解液經(jīng)活性炭脫毒后糖的損失率極差如圖1所示，沙柳水酶解液活性炭脫色率極差如圖2所示。

表2 沙柳水解液活性炭脫毒正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results of activated carbon detoxified Salix hydrolysate

圖1 沙柳水解液經(jīng)活性炭脫毒后糖的損失率極差圖Fig.1 Range chart of sugar loss rate for activated carbon detoxified Salix hydrolysate

圖2 沙柳酶解液活性炭脫色率極差Fig.2 Range chart of decoloration rate for activated carbon treated Salix hydrolysate

從圖1可以看出：在所選擇的正交試驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)，沙柳水解液活性炭脫毒對(duì)糖的損失率影響不顯著，糖損失率在5%以內(nèi)，沙柳水解液活性炭脫毒過(guò)程中會(huì)有少量的糖成分被吸附而損失，同時(shí)隨活性炭添加量的增大，糖的損失率也會(huì)增大。

從圖2可以看出：沙柳水解液的活性炭脫色效果比較顯著，活性炭由于具有芳香環(huán)式的結(jié)構(gòu)，善于吸附芳香族有機(jī)物（纖維素酶解液中的有色物質(zhì)大部分屬于這類），它對(duì)不帶電物質(zhì)的吸附力較強(qiáng)，而對(duì)帶負(fù)電的陰離子物質(zhì)吸附力相對(duì)較弱，活性炭對(duì)物質(zhì)的吸附與溶液pH有關(guān)，pH的變化可以導(dǎo)致色素分子所帶靜電荷量或立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此在酸性溶液中吸附較強(qiáng)，堿性溶液中較弱。因?yàn)槿跛嵝晕镔|(zhì)在低pH下帶電較少，甚至不帶電，較易被吸附，高pH下電荷較強(qiáng)，不利于吸附，所以水解液中大部分降解的有色化合物在活性炭處理過(guò)程中被吸附，pH 4.8達(dá)到最大吸附量［20-22］。

在選擇的實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，脫色率隨溫度的升高先增加后降低，說(shuō)明隨著水解液溫度的升高，分子擴(kuò)散速度加快，色素分子更容易進(jìn)入活性炭孔隙內(nèi)的吸附位點(diǎn)，縮短了達(dá)到吸附平衡的時(shí)間，從而增加了吸附容量，提高了脫色率。另一方面，溫度的繼續(xù)升高會(huì)使分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，容易導(dǎo)致已吸附的色素分子脫離，而活性炭處理是一個(gè)吸附和解吸的可逆過(guò)程，因此過(guò)高的溫度對(duì)活性炭處理效果反而不明顯?；钚蕴坑昧康脑黾?，可以增加水解液的脫色效果。通過(guò)圖2和圖1對(duì)比分析，可以得到最優(yōu)的活性炭處理?xiàng)l件：A2B2C2D1，即pH 4.8，碳加量4%，溫度70℃，1 h。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，糖損失率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：該條件下蒸爆處理水解液的脫色率達(dá)到97.4%，糖損失率3.1%；超微粉碎+稀酸處理水解液的脫色率95.3%，糖損失率2.1%；超微粉碎+稀堿處理水解液的脫色率96.4%，糖損失率2.3%。

2.2 沙柳原料水解液脫毒后丁醇發(fā)酵效果考察

在木質(zhì)纖維素原料酶解糖化過(guò)程中，通常采用分批補(bǔ)料的酶解方式來(lái)增大底物濃度，從而獲得較高濃度的糖液和發(fā)酵產(chǎn)物。以葡萄糖或淀粉為原料的傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵，丙酮、丁醇、乙醇的質(zhì)量濃度（總?cè)軇ˋBE））為20 g/L左右，從葡萄糖到總?cè)軇┑睦碚撧D(zhuǎn)化率為39.2%，難以超過(guò)這一閾值的原因在于所生成的溶劑特別是丁醇對(duì)梭菌細(xì)胞有毒副作用，因此木質(zhì)纖維素原料的酶解液初始糖質(zhì)量濃度控制在50～60 g/L比較合適。本實(shí)驗(yàn)中筆者將沙柳原料的酶解液糖濃度控制在上述范圍內(nèi)，即蒸爆處理原料酶解液總糖質(zhì)量濃度57 g/L，超微粉碎+稀酸處理原料酶解液總糖質(zhì)量濃度50 g/L，超微粉碎+稀堿處理原料酶解液總糖質(zhì)量濃度56 g/L［10，23］。脫毒沙柳水解糖液發(fā)酵產(chǎn)丁醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出：3種預(yù)處理原料中蒸氣爆破預(yù)處理原料總糖濃度最高，每克底物濾紙酶用量為15 U，相對(duì)酶用量最少，因此蒸氣爆破預(yù)處理原料水解效果最好。3種預(yù)處理方法的機(jī)制不同，沙柳原料經(jīng)蒸氣爆破預(yù)處理后，其致密的纖維束相互分開松散，天然纖維的部分結(jié)晶結(jié)構(gòu)和內(nèi)部氫鍵被破壞，物料中半纖維素和部分木質(zhì)素被降解，這些因素都有利于增加纖維素酶的可及度，從而提高原料的酶水解率［16，24］。超微粉碎+稀堿預(yù)處理、超微粉碎+稀酸預(yù)處理過(guò)程可以將天然纖維素復(fù)雜的剛性結(jié)構(gòu)破壞，纖維素的結(jié)晶度降低，原料結(jié)構(gòu)變得疏松，從而增大纖維素與纖維素酶的接觸面積，進(jìn)而提高了超微粉碎沙柳原料的酶解效率［17-18，25-27］，但是其微觀的纖維結(jié)構(gòu)沒有充分破壞，從而限制了預(yù)處理原料水解率的提升。

圖3 脫毒沙柳水解糖液發(fā)酵產(chǎn)丁醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Butanol fermentation results of detoxified Salix hydrolysate

從圖3還可以看出：蒸氣爆破、超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀堿處理的沙柳原料水解糖液經(jīng)活性炭脫毒后，能夠較好地被丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）利用，總糖利用率在92%以上。沒有經(jīng)過(guò)活性炭脫毒處理的沙柳水解糖液不能被丙酮丁醇梭菌利用，并且接入水解液的發(fā)酵菌種被發(fā)酵抑制物毒死，因此水解液中沒有發(fā)酵產(chǎn)物，所以該組數(shù)據(jù)沒有表示在圖3中。通過(guò)對(duì)活性炭脫毒處理后的沙柳水解糖液發(fā)酵產(chǎn)物分析可以看出，總?cè)軇┌l(fā)酵質(zhì)量濃度約為14 g/L，低于傳統(tǒng)丁醇梭菌發(fā)酵的理論產(chǎn)率，傳統(tǒng)的丁醇梭菌發(fā)酵以葡萄糖作為C源，發(fā)酵液中總?cè)軇┵|(zhì)量濃度可以達(dá)到20 g/L。分析原因可能是：①雖然活性炭脫毒處理可以將預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物脫除，但是水解液中比較復(fù)雜的糖組分影響了菌種的糖醇轉(zhuǎn)化率；②需要針對(duì)沙柳預(yù)處理原料水解液的丁醇發(fā)酵條件做進(jìn)一步優(yōu)化，以提高其發(fā)酵效果和糖醇轉(zhuǎn)化率；③通過(guò)馴化、誘變等技術(shù)手段改造發(fā)酵菌株以提高其對(duì)復(fù)雜糖組分的糖醇轉(zhuǎn)化率。

3 結(jié)論

1）通過(guò)對(duì)蒸爆、超微粉碎+稀酸和超微粉碎+稀堿3種預(yù)處理沙柳原料補(bǔ)料酶解效果的考察，獲得了較高糖濃度的沙柳水解液，蒸氣爆破預(yù)處理原料的酶解效果最好，最終底物質(zhì)量濃度為200 g/mL、每克底物濾紙酶加量15 U條件下，酶解液總糖（葡萄糖、木糖、纖維二糖之和）質(zhì)量濃度達(dá)到57 g/L。

2）優(yōu)化了沙柳酶解液的活性炭脫毒條件，得到最優(yōu)的條件：pH 4.8、活性炭添加量4%、溫度70℃和1 h，該條件下的沙柳水解液脫色率達(dá)到97.4%，糖損失率3.1%。

3）通過(guò)對(duì)蒸爆、超微粉碎+稀酸和超微粉碎+稀堿3種預(yù)處理沙柳原料酶解液活性炭脫毒后的發(fā)酵效果考察，可以看出，3種預(yù)處理方法所得沙柳水解液經(jīng)活性炭脫毒后都可以較好地被丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）利用，發(fā)酵液中總?cè)軇┵|(zhì)量濃度約為14 g/L，略低于傳統(tǒng)丙酮丁醇發(fā)酵的理論產(chǎn)率。將來(lái)可以針對(duì)產(chǎn)丁醇的高產(chǎn)菌株做進(jìn)一步的優(yōu)化研究，以提高沙柳原料的丁醇發(fā)酵轉(zhuǎn)化率。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Butanol production from detoxified Salix hydrolysate

LIN Zengxiang1，2，LI Rongxiu2，LIU Li1，SHEN Zhaobing1，SHI Jiping1
（1.Research Center for Sustainable Technology，Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201210，China；2.Key Laboratory of Microbial Metabolism of Ministry of Education，College of Life Science and Biotechnology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

In this study，we studied methods to improve butanol fermentation of Salix hydrolysates after pretreatment and enzymatic hydrolysis.Salix samples were pretreated by steam explosion，ultrafine grind with dilute acid and ultrafine grind with dilute alkali，respectively.Before acetone-butanol-ethanol（ABE）fermentation，we optimized the feeding enzyme hydrolysis and activated carbon detoxification. Steam explosion pretreated Salix samples had the highest sugar yield（57 g/L） after enzymatic hydrolysis，with 200 g/mL substrate consistency，15 FPU enzyme loading for 96 hours.The optimal condition of activated carbon detoxification was observed with 4%activated carbon loading at pH 4.8 and 70℃ for 1 hour.Under that condition，hydrolysate was decoloarated by 97.4%with 3.1%sugar loss. The detoxified Salix hydrolysates of three pretreatment methods could be fermented by Clostridium acetobutylicums，and the total product solvent（ABE）was about 14 g/L.

Salix；pretreatment；feeding enzymatic hydrolysis；fermentation；butanol

S216.2

A

1672-3678（2015）01-0012-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.003

2013-04-15

上海市科委項(xiàng)目（10dz1210400）；上海浦東博士后基金（Y234081D01）

林增祥（1980—），男，新疆博樂人，博士后，研究方向：生物化工；史吉平（聯(lián)系人），研究員，E-mail：shijp@sari.ac.cn