Kluyveromyces marxianus發(fā)酵己糖和戊糖生產(chǎn)乙醇

韓錫銅，高教琪，陳麗杰，袁文杰，白鳳武

（大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023）

Kluyveromyces marxianus發(fā)酵己糖和戊糖生產(chǎn)乙醇

韓錫銅，高教琪，陳麗杰，袁文杰，白鳳武

（大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023）

對(duì)利用底物廣泛的乙醇發(fā)酵菌株馬克斯克魯維（Kluyveromyces marxianus）DL1菌株與工業(yè)用乙醇發(fā)酵菌株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）6525利用己糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖）和戊糖（木糖、阿拉伯糖）的情況進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以己糖為底物時(shí)，K.marxianus DL1均表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)快、乙醇得率高的特點(diǎn)；在不通氣、糖20 g/L條件下，K.marxianus DL1的最大乙醇質(zhì)量濃度均比S.cerevisiae 6525高出10%左右，細(xì)胞量及乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度分別是S.cerevisiae 6525的近2和1.7倍。當(dāng)以戊糖為底物時(shí)，K.marxianus DL1可以利用木糖和阿拉伯糖；在不通氣、糖20 g/L條件下，K.marxianus DL1利用木糖產(chǎn)木糖醇和乙醇，乙醇終質(zhì)量濃度可達(dá)7.68 g/L，木糖醇質(zhì)量濃度為9.12 g/L；以阿拉伯糖為發(fā)酵底物時(shí)，阿拉伯糖醇的產(chǎn)量可達(dá)6 g/L左右；而S.cerevisiae 6525不能利用戊糖。馬克斯克魯維酵母比釀酒酵母更適合纖維乙醇生產(chǎn)。

馬克斯克魯維酵母；釀酒酵母；乙醇發(fā)酵；戊糖；己糖

迄今為止，燃料乙醇是研究最熱且被公認(rèn)為擁有廣闊發(fā)展前景的生物清潔能源之一［1］。目前，大規(guī)模投入生產(chǎn)的原料是以淀粉和糖類為主，然而，“不與人爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地”的基本國(guó)策嚴(yán)重限制了燃料乙醇的規(guī)?；a(chǎn)［2-3］。

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是當(dāng)今世界上來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、可再生性的生物質(zhì)原料，其主要成分包括纖維素、半纖維素和木素。在植物纖維中，纖維素和半纖維素占到原料干質(zhì)量的50%以上［4］，分解產(chǎn)物分別為葡萄糖、甘露糖、半乳糖等己糖以及木糖、阿拉伯糖等戊糖［5］。與葡萄糖相比，大量的戊糖資源尚未得到同等有效利用，成為纖維原料生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵之一。

Kluyveromyces marxianus屬于非常規(guī)酵母，利用其高溫特性和能夠發(fā)酵多種底物的特點(diǎn)而進(jìn)行的乙醇發(fā)酵已引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注［6-8］。早在20世紀(jì)80年代，就有關(guān)于K.marxianus發(fā)酵木糖的報(bào)道，但由于乙醇產(chǎn)率較低，未能引起重視［9］。隨著纖維素乙醇的發(fā)展及對(duì)K.marxianus認(rèn)識(shí)的加深，人們對(duì)K.marxianus在纖維素乙醇轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用重新提上日程。Watanabe等［10］將來(lái)源于不同酵母的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在K.marxianus中表達(dá)，一定程度上提高了K.marxianus代謝木糖的速率。國(guó)內(nèi)洪炯課題組首次鑒定了K.marxianus代謝木糖途徑的3個(gè)重要基因：木糖脫氫酶［11］、木酮糖激酶［12］及木糖醇還原酶［13］，為研究K.marxianus在發(fā)酵木糖中的應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。但由于這些菌株的產(chǎn)乙醇性能較差，尚不能滿足工業(yè)化應(yīng)用要求。

筆者將本實(shí)驗(yàn)室成員自行選育得到的能夠發(fā)酵木糖的K.marxianus菌株以及工業(yè)用乙醇發(fā)酵菌株S.cerevisiae 6525在不同C源條件下的生長(zhǎng)、發(fā)酵狀況進(jìn)行研究對(duì)比，以期篩選出更具有優(yōu)勢(shì)的乙醇生產(chǎn)菌種，使其能夠較高效地發(fā)酵戊糖（木糖、阿拉伯糖），使之具有成為纖維素乙醇生產(chǎn)菌株的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

馬克斯克魯維酵母 Kluyveromyces marxianus DL1和 DL2，本實(shí)驗(yàn)室成員篩選；Kluyveromyces marxianus 1727、乳酸克魯維酵母 Kluyveromyces lactis，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物保藏中心，編號(hào)分別為1727和1772；釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 6525（工業(yè)界贈(zèng)送）。以上菌株由大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基（g/L）：糖類20（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖），酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂粉18。

活化培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，（NH4）2SO45.0，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 0.5，微量元素（EDTA 0.015，ZnSO4·7H2O 0.004 5，MnCl2·2H2O 0.000 84，CoCl2·6H2O 0.000 3，CuSO4·5H2O 0.000 3，Na2MoO4·2H2O 0.000 4，CaCl2·2H2O 0.004 5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003，H3BO30.001，KI 0.000 1），生物素0.000 05，泛酸鈣0.001，煙酸0.001，肌醇0.025，維生素B1 0.001，維生素B6 0.001，對(duì)氨基苯甲酸0.000 2。

生長(zhǎng)培養(yǎng)基（g/L）：糖類20（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖），其余成分同種子培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：糖類40（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖），其余成分同種子培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)兩級(jí)種子活化，將種子液以10%的體積分?jǐn)?shù)接入有效體積為100 mL的搖瓶培養(yǎng)基中，搖瓶分別用8層紗布（微量通氣）和厭氧塞封口（不通氣）。30℃、150 r/min培養(yǎng)。定時(shí)取樣，測(cè)定生物量、糖以及各種代謝產(chǎn)物濃度。

1.2.2 分析方法

生物量測(cè)定方法：采用OD值法，將菌液適當(dāng)稀釋，在波長(zhǎng)為620 nm處測(cè)定其吸光值。

發(fā)酵液代謝產(chǎn)物的分析：發(fā)酵液在 10 000 r/min下離心5 min，取上清液，用孔徑為0.22 μm的水膜過(guò)濾，利用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、木糖醇、阿拉伯醇、甘油、乙酸和乙醇的含量。色譜柱的型號(hào)為Aminex HPX-87H。流動(dòng)相為0.01 mol/L H2SO4水溶液，流速0.5 mL/min，分別使用紫外檢測(cè)器（檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm）和示差檢測(cè)器。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析方法

2 結(jié)果與討論

2.1 在平板培養(yǎng)條件下C源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將具有較好發(fā)酵乙醇能力的克魯維屬菌株和釀酒酵母，劃線接種于不同C源的平板培養(yǎng)基上，考察每個(gè)菌株對(duì)不同C源的利用情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知：5種菌都能利用己糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖），且各菌株的生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異；K.marxianus DL1、K.marxianus 1727、K.lactis能利用戊糖（木糖、阿拉伯糖），其中，K.marxianus DL1、K.marxianus 1727的生長(zhǎng)狀況要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于K.lactis。

圖1 菌株在不同C源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of strains on different carbon medium

2.2 在微通氣條件下C源對(duì)菌株生長(zhǎng)性狀的影響

2.2.1 以己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）為C源

5株菌以己糖為底物時(shí)的發(fā)酵數(shù)據(jù)如表1和圖2所示。由表1和圖2可知：以20 g/L葡萄糖為底物，5株菌的生長(zhǎng)比較類似。接種后4 h內(nèi)均處于延遲期，葡萄糖消耗速率緩慢，4 h后，2株菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，葡萄糖消耗速率加快。K.marxianus DL1和K.marxianus 1727耗糖速率明顯比其他3株菌快，并均在第10小時(shí)將葡萄糖耗完，而K.marxianus DL2、K.lactis和S.cerevisiae 6525則分別在第12、20和12小時(shí)生長(zhǎng)結(jié)束。在生物量方面，K.marxianus DL1、K.marxianus 1727和K.marxianus DL2的生長(zhǎng)狀況相似，且明顯優(yōu)于K.lactis和 S.cerevisiae 6525。其中K.marxianus DL1的 OD620最 大 達(dá) 到 3.25，是S.cerevisiae 6525的最大OD620的1.47倍。在產(chǎn)物方面，各菌株都能夠在微通氣條件下將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇，可能原因是通氣量較低時(shí)，隨著細(xì)胞生物量增多，培養(yǎng)基溶氧降低或出現(xiàn)無(wú)氧狀態(tài)。K.marxianus DL1在己糖代謝能力方面幾乎與目前報(bào)道的優(yōu)良菌株相似［14］，甚至在發(fā)酵時(shí)間以及生物量生產(chǎn)等方面還具有一定的優(yōu)勢(shì)。Rodrussamee等［15］利用K.marxianus DMKU 3-1042在有機(jī)培養(yǎng)基中發(fā)酵葡萄糖于12 h達(dá)到終點(diǎn)，而K.marxianus DL1在營(yíng)養(yǎng)相對(duì)匱乏的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中可以實(shí)現(xiàn)更快的發(fā)酵過(guò)程（10 h左右），因此，更高的發(fā)酵效率是K.marxianus DL1有別于目前報(bào)道的克魯維屬菌株的一個(gè)重要特征。

表1 以己糖為底物時(shí)菌株的生長(zhǎng)參數(shù)Table 1 Growth parameters of strains using hexose as substrate

圖2 以葡萄糖為底物時(shí)K.marxianus DL1和S.cerevisiae 6525菌株的生長(zhǎng)狀況Fig.2 Growth of strains（K.marxianus DL1 and S.cerevisiae 6525）using glucose as substrate

2.2.2 以戊糖（木糖、阿拉伯糖）為C源

K.marxianus DL1、K.marxianus 1727和K.lactis以戊糖為底物時(shí)的發(fā)酵數(shù)據(jù)如表2和圖3所示。由表2和圖3可知：K.marxianus DL1同樣具有乙醇得率高，生產(chǎn)強(qiáng)度大的優(yōu)勢(shì)。以20 g/L木糖為底物，K.marxianus DL1消耗木糖的速率明顯比K.marxianus 1727快，在84 h時(shí)，木糖基本耗盡，而K.marxianus 1727發(fā)酵至96 h時(shí)仍有殘?zhí)?.62 g/L。在生物量方面，K.marxianus DL1 OD620最大達(dá)到5.38，是K.marxianus 1727最大OD620的1.11倍。同時(shí)，K.marxianus屬的酵母在以木糖為C源時(shí)的細(xì)胞得率比以葡萄糖為C源時(shí)更高。在產(chǎn)物方面，K.marxianus DL1可以利用木糖同時(shí)生產(chǎn)乙醇和木糖醇，在48 h時(shí)，木糖醇產(chǎn)量達(dá)到最大（2.05 g/L）。乙醇的產(chǎn)量則從24 h開(kāi)始逐漸上升，至72 h時(shí)趨于穩(wěn)定，最終質(zhì)量濃度為1.71 g/L。K.marxianus 1727不能利用木糖生產(chǎn)乙醇，只能生產(chǎn)木糖醇，其產(chǎn)量隨時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，84 h時(shí)趨于穩(wěn)定，終質(zhì)量濃度為2.96 g/L。

表2 以戊糖為底物時(shí)菌株的生長(zhǎng)參數(shù)Table 2 The growth parameters of strains using pentose as substrate

圖3 以木糖為底物時(shí)K.marxianus DL1和S.cerevisiae 1727菌株的生長(zhǎng)狀況Fig.3 Growth of strains（K.marxianus DL1 and S.cerevisiae 1727）using xylose as substrate

2.3 在不通氣條件下不同C源對(duì)菌株的發(fā)酵性狀影響

在不通氣條件下，5株菌以己糖為底物時(shí)的發(fā)酵數(shù)據(jù)如表3所示。由表3可知：K.marxianus DL1是優(yōu)秀的乙醇生產(chǎn)菌株，與工業(yè)釀酒菌株S.cerevisiae 6525相比，乙醇產(chǎn)量、得率是S.cerevisiae 6525的1.13倍，且生產(chǎn)強(qiáng)度是S.cerevisiae 6525的1.7倍。在微量通氣條件下 K.marxianus DL1的乙醇得率與S.cerevisiae 6525相近；而在不通氣的發(fā)酵條件下，K.marxianus DL1的乙醇得率及生產(chǎn)強(qiáng)度均優(yōu)于微通氣條件。出現(xiàn)上述原因可能是微通氣條件下，溶氧含量相對(duì)多，較多的O2供細(xì)胞快速增殖，在有氧且C源不足時(shí)，乙醇會(huì)被當(dāng)做C源來(lái)利用。而在不通氣的條件下，乙醇的產(chǎn)量明顯提高，這與Salmon［16］的研究結(jié)果相似。與K.marxianus DL1相比，S.cerevisiae 6525在不通氣條件下的乙醇得率及生產(chǎn)強(qiáng)度反而比微氧條件下的值要低，這可能是由于大量甘油的合成降低了乙醇的產(chǎn)率和C源的利用率［17］。

表3 以己糖為底物時(shí)菌株的發(fā)酵參數(shù)Table 3 The fermentation parameters of strains using hexose as substrate

圖4（A）為K.marxianus DL1以木糖為C源時(shí)的發(fā)酵情況。由圖4（A）可知：K.marxianus DL1在第144小時(shí)將木糖基本耗盡，乙醇在第120小時(shí)達(dá)到最大（7.68 g/L）。除乙醇外，K.marxianus DL1還能產(chǎn)生木糖醇和乙酸，其中K.marxianus DL1的木糖醇和乙酸的產(chǎn)量分別在96 h（9.12 g/L）和120 h（1.46 g/L）時(shí)達(dá)到最大。

圖4（B）為K.marxianus DL1以阿拉伯糖為C源時(shí)的發(fā)酵情況。由圖4（B）可知：120 h發(fā)酵達(dá)到終點(diǎn)，仍有殘?zhí)?2.25 g/L。阿拉伯糖醇產(chǎn)量最高達(dá)至5.96 g/L。盡管發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有乙醇產(chǎn)出，但更多的C源卻用來(lái)合成生物量，K.marxianus DL1的最大OD620達(dá)到5.43，細(xì)胞得率要遠(yuǎn)高于以木糖為底物時(shí)的得率。

圖4 不通氣條件下K.marxianus DL1以戊糖為底物的發(fā)酵狀況Fig.4 Fermentation of K.marxianus DL1 using pentose as substrate in anaerobic conditions

K.marxianus DL1能較高效轉(zhuǎn)化戊糖［9，18］。雖然目前K.marxianus DL1發(fā)酵木糖的速率略低于一些基因工程菌，但在乙醇產(chǎn)量方面具有優(yōu)勢(shì)［19］。此外，K.marxianus代謝阿拉伯糖不產(chǎn)生乙醇，但是，K.marxianus代謝阿拉伯糖產(chǎn)阿拉伯醇的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于同類菌株［20］，因此，筆者推測(cè)，K.marxianus DL1中可能存在特異的木糖和阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及代謝途徑，這將是K.marxianus DL1未來(lái)一個(gè)很重要的應(yīng)用，并且尚沒(méi)有菌株能夠同時(shí)利用木糖和阿拉伯糖的報(bào)道。

3 結(jié)論

與工業(yè)用乙醇發(fā)酵菌株S.cerevisiae 6525相比，K.marxianus DL1是1株降糖速度快、乙醇產(chǎn)量高的菌株，能夠更好地代謝木糖、阿拉伯糖，對(duì)于纖維素類原料水解液的全面利用更具有優(yōu)勢(shì)。

當(dāng)以葡萄糖、甘露糖和半乳糖為底物時(shí)，在微量通氣條件下，K.marxianus DL1具有生長(zhǎng)速度快、乙醇得率高及生產(chǎn)強(qiáng)度大的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)以20 g/L葡萄糖為底物時(shí)，K.marxianus DL1于10 h發(fā)酵結(jié)束，并達(dá)到最大乙醇產(chǎn)量（7.96 g/L）。盡管乙醇產(chǎn)量和得率與S.cerevisiae 6525相近，但乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度卻是S.cerevisiae 6525的1.25倍。在不通氣條件下，以42 g/L葡萄糖為底物時(shí)，K.marxianus DL1的乙醇產(chǎn)量、得率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別比 S.cerevisiae 6525高出近13%、13%和70%。這可能是由于S.cerevisiae 6525代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量的甘油，降低了乙醇的產(chǎn)率。

當(dāng)以木糖和阿拉伯糖為底物時(shí)，在微量通氣與不通氣條件下，只有K.marxianus DL1能夠發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇，發(fā)酵阿拉伯糖產(chǎn)阿拉伯醇。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Ethanol production from hexose and pentose by Kluyveromyces marxianus

HAN Xitong，GAO Jiaoqi，CHEN Lijie，YUAN Wenjie，BAI Fengwu
（Life Science and Bioengineering，Dalian University of Technology，Dalian 116023，China）

Kluyveromyces marxianus DL1 and Saccharomyces cerevisiae 6525 were compared by using hexose（glucose，mannose and galactose）and pentose（xylose and arabinose）as substrates.When hexoses were used as substrates，K.marxianus showed the characteristic of fast growth and higher ethanol yield.Under the condition of anaerobic and 20 g/L sugar concentration，the ethanol concentration of K.marxianus DL1 was 10%higher than that of S.cerevisiae 6525，and the biomass and the ethanol productivity of K. marxianus DL1 were 2 and 1.7 times to that of S.cerevisiae 6525.When pentoses were used as the substrate under the conditions of anaerobic and 20 g/L sugar concentration，S.cerevisiae 6525 could not use pentoses whereas K.marxianus DL1 could use xylose to produce ethanol and xylitol，and the concentration reached 7.68 g/L and 9.12 g/L，respectively.K.marxianus DL1 could also ferment arabinose to produce 6 g/L arabitol.K.marxianus DL1 is more suitable for cellulosic ethanol production than Saccharomyces cerevisiae.

Kluyveromyces marxianus；Saccharomyces cerevisiae；ethanol fermentation；pentose；hexose

TS262

A

1672-3678（2015）01-0006-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.002

2013-11-14

國(guó)家自然科學(xué)基金（2110616）；遼寧省博士啟動(dòng)基金（20111028）

韓錫銅（1988—），男，吉林長(zhǎng)春人，碩士研究生，研究方向：纖維素乙醇；袁文杰（聯(lián)系人），副教授，E-mail：ywj@dlut.edu.cn