無血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞的研究進(jìn)展

董慧君 曾憲卓 魯 菲 郭明輝 張 哲

（深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司，廣東 深圳518057）

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，單克隆抗體、細(xì)胞因子、疫苗和各種生物活性蛋白等生物制品在診斷和治療中應(yīng)用日益廣泛，其需求量大大增加，因此，通過體外大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞生產(chǎn)生物制品技術(shù)的研究越來越受到青睞。CHO細(xì)胞是生產(chǎn)蛋白類生物制品最重要的表達(dá)系統(tǒng)，采用無血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞相比含血清培養(yǎng)，能避免對實(shí)驗(yàn)動物的傷害、潛在的污染源影響、不同批次血清間的生物活性和因子的不一致及價格高等諸多弊端，因而受到生物制藥領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。

1 CHO細(xì)胞

CHO細(xì)胞即中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary Cell)，是最具代表性的動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。它建株于1957年，由美國科羅拉多大學(xué)Theodore T.Puck從一成年雌性中國倉鼠卵巢中分離得到，是一種連續(xù)細(xì)胞系，能傳百代以上，具有永生性。后來陸續(xù)又有很多科學(xué)家用藥物加壓、極端條件篩選和誘導(dǎo)突變等方法篩選得到了一系列不同表型的CHO細(xì)胞株[1]，如DUKX-B11、DG-44和CHO-K1等。

CHO細(xì)胞能用于表達(dá)各種復(fù)雜的重組蛋白。據(jù)統(tǒng)計，70%以上的動物細(xì)胞表達(dá)藥物產(chǎn)品都是以CHO細(xì)胞為表達(dá)宿主[2]。2011年6月批準(zhǔn)的27種單克隆抗體中，其中13種就是通過CHO細(xì)胞表達(dá)的，占了約50%的比例。

CHO細(xì)胞之所以成為最受歡迎的宿主細(xì)胞，主要在于其易于培養(yǎng)以及基因操作，而且相比其他表達(dá)系統(tǒng)，它還具有許多優(yōu)點(diǎn)[3-4]：①具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有產(chǎn)物胞外分泌功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；③具有外源重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；④既可貼壁生長也可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，外源蛋白表達(dá)水平較高；⑤CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的后分離。

2 無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基是繼天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基之后的第三類培養(yǎng)基。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基不含動物血清或其他動物提取成分，但仍可滿足細(xì)胞在體外較長時間生長、繁殖的一種培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分兩部分組成?；A(chǔ)培養(yǎng)基含有各種營養(yǎng)物質(zhì)，能維持組織或細(xì)胞的生長、發(fā)育、遺傳、繁殖等一系列生命活動。目前應(yīng)用最廣泛的是MEM、DMEM、RPMI1640等。添加組分為各種代替血清的因子總稱，主要包括促貼壁物質(zhì)、生長因子與激素、酶抑制劑、結(jié)合蛋白以及微量元素等幾大類。這些因子既能滿足細(xì)胞的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素[5-6]。

3 無血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞的研究進(jìn)展

隨著生物制品的需求加大以及無血清培養(yǎng)基諸多優(yōu)勢，越來越多的生物制藥公司開始采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細(xì)胞，研制適合于CHO細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)的低成本無血清培養(yǎng)基是生物制藥領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

3.1 無血清培養(yǎng)基成分研究

無血清培養(yǎng)基的成分相對比較清楚，人們可根據(jù)培養(yǎng)目的及細(xì)胞種類的不同，對培養(yǎng)基成分進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，以達(dá)到更好地培養(yǎng)目的。

研究證明，在無血清培養(yǎng)基中添加蛋白水解物可以提高最大細(xì)胞密度和生產(chǎn)效率。酵母水解物可作為一種低成本的無血清培養(yǎng)基添加物，用以成產(chǎn)人血小板生成素（hTPO）[7]。大豆水解物能較好地支持細(xì)胞生長和維持細(xì)胞活性[8]。Ballez等[9]研發(fā)出一種培養(yǎng)CHO-320細(xì)胞生產(chǎn)IFNγ的無蛋白培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中添加了大米水解物，最終最大細(xì)胞密度能提高25%，IFNγ濃度能提高60%。

還有研究評價激素、脂類及微量元素等成分對無血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞的影響。趙麗麗等[10]以表達(dá)重組TNFR-Fc融合蛋白的CHOK1細(xì)胞為研究對象，確定大豆蛋白水解物和酵母提取物的混合物、地塞米松及脂肪乳劑這幾種關(guān)鍵組分對培養(yǎng)基的影響，為適合于細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)的低成本無血清培養(yǎng)基的研制提供了參考。張大鶴等[11]研制出兩種適于重組CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。微量元素完全可以替換無血清培養(yǎng)基中的蛋白，支持細(xì)胞生長和促進(jìn)蛋白表達(dá)。通過優(yōu)化調(diào)整其他營養(yǎng)物質(zhì)，去除蛋白水解物，且不需添加任何小肽化合物后，仍能支持高密度的CHO細(xì)胞培養(yǎng)。

添加氨基酸有利于維持細(xì)胞活性與抗體合成；添加B族維生素能促進(jìn)細(xì)胞生長并延長培養(yǎng)時間；葡萄糖濃度較高時會抑制細(xì)胞生長，而濃度較低時又不能有效支持細(xì)胞的生長與抗體的合成，因此需要維持適當(dāng)?shù)臐舛?。通過合理調(diào)整這幾類營養(yǎng)物的濃度配比形成的優(yōu)化無蛋白培養(yǎng)基，可使培養(yǎng)的CHO細(xì)胞最高密度達(dá)到52.6×105cells/mL，抗體產(chǎn)量達(dá)到274mg/L，與初始培養(yǎng)基相比分別提高了33%和63%[12]。

通過對無血清培養(yǎng)基成分的適當(dāng)調(diào)整和改進(jìn)，可以實(shí)現(xiàn)對某一類細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物快速、專一的培養(yǎng)目的，如何將這些改進(jìn)應(yīng)用到大規(guī)模生產(chǎn)中還需要進(jìn)一步的研究。

3.2 適用于懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基

懸浮培養(yǎng)是哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究和應(yīng)用的重要模式和首要選擇[13-14]。CHO細(xì)胞為貼壁依賴性細(xì)胞，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)面臨的最大問題就是細(xì)胞易集結(jié)成團(tuán)使得細(xì)胞生長緩慢，且細(xì)胞團(tuán)中央細(xì)胞因營養(yǎng)不足而容易凋亡。對于CHO細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)而言，培養(yǎng)基是影響細(xì)胞生長和目標(biāo)表達(dá)產(chǎn)物生產(chǎn)的最重要因素之一。目前已有適于CHO細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的商業(yè)化無血清培養(yǎng)基，但存在成分復(fù)雜、不明確及知識產(chǎn)權(quán)問題，影響培養(yǎng)基的進(jìn)一步優(yōu)化，且價格昂貴成本高，因此開發(fā)基于懸浮培養(yǎng)工藝的個性化無血清培養(yǎng)基至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)腐胺、胰島素及轉(zhuǎn)鐵蛋白對11G-S細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)具有明顯的生長促進(jìn)作用，劉興茂等[15]選擇商業(yè)化的DMEM/F12(1∶1,V/V)為無血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并選取了腐胺、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺、β-巰基乙醇等常用添加劑，得到SFM-CHO-S無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)效果優(yōu)于商品化的同類無血清培養(yǎng)基。郭紀(jì)元[16]從CHO細(xì)胞培養(yǎng)基庫中篩選得到無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基BM，在此基礎(chǔ)上調(diào)整酵母水解物、硫酸葡聚糖、檸檬酸鐵及起始葡萄糖與氨代謝相關(guān)氨基酸濃度，獲得其個性化無血清培養(yǎng)基Opti-BM，并研發(fā)得到相應(yīng)的流加懸浮培養(yǎng)基FM與FM plus。

孫亞婷[17]研制出PFIA無血清無蛋白培養(yǎng)基，比HyQ和Ex-302兩種商業(yè)無血清培養(yǎng)基效果好，可作為后續(xù)流加培養(yǎng)的初始培養(yǎng)基。謝奎[18]獲得自主知識產(chǎn)權(quán)的無血清培養(yǎng)基，經(jīng)驗(yàn)證蛋白表達(dá)結(jié)果優(yōu)于商業(yè)化培養(yǎng)基CD DG44，接近商業(yè)培養(yǎng)基P8，且成本節(jié)約一半以上。Zhang等[19]以表達(dá)重組TNFR-Fc融合蛋白的CHO-GS細(xì)胞為研究對象，以DMEM：F12：RPMI1640(2：1：1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過調(diào)整添加氨基酸、胰島素、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及Pluronic F68，并結(jié)合流加培養(yǎng)工藝，研制出適合CHO懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。

4 結(jié)語

隨著重組蛋白、單克隆抗體及病毒疫苗需求量的加大，動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究越來越多，也取得很大進(jìn)展。隨著對細(xì)胞營養(yǎng)與代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及外源蛋白表達(dá)機(jī)制等各方面機(jī)理的深入研究，以及蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)[20]在細(xì)胞培養(yǎng)基設(shè)計和研究上的應(yīng)用，必將為進(jìn)一步推進(jìn)哺乳動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)，從而使細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物制備、基因工程、細(xì)胞移植等領(lǐng)域得到更安全、更低成本和更廣泛的應(yīng)用。

［1］Lee JH,Kim YG,?Lee GM.Effect of Bcl-xL overexpression on sialylation of Fcfusion protein in recombinant Chinese hamster ovary cell cultures[J].Biotechnol Prog,2015,31(4)：1133-1136.

［2］Jayapal KP,Wlaschin KF,Yap MGS,et al.Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting[J].Chemical Engineering Progress,2007,103(10)：40-47.

［3］Ballez JS,Mols J,Burteau C,et al.Plant protein hydrolysates support CHO-320 cells proliferation and recombinant IFN-gamma production in suspension and inside microcarriers in protein-free media[J].Cytotechnology,2004,44(3)：103-114.

［4］Betanska K,Czogalla S,Spindler-Barth M,et al.Influence of cell cycle on ecdysteroid receptor in CHO-K1 cells[J].Arch Insect Biochem Physiol,2009,72(3)：142-153.

［5］楊鳳鐸,李明,董春柳.無血清培養(yǎng)基概述及應(yīng)用前景[J].科技視界,2012,36：48.

［6］宗超,黃磊,蔡謹(jǐn),等.無血清培養(yǎng)基中蛋白類補(bǔ)充因子重組生產(chǎn)研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2014,21(2)：162-165.

［7］Sung YH,Lim SW,Chung JY,et al.Yeast hydrolysate as a low cost additive to serum-free medium for the production of human thrombopoietin in suspension cultures of Chinese hamster ovary cells[J].Appl Microbiol Biotechnol,2004,63(5)：527-536.

［8］Chun BH,Kim JH,Lee HJ,et al.Usability of size-excluded fractions of soy protein hydrolysates for growth and viability of Chinese hamster ovary cells in protein-free suspension culture[J].Bioresour Technol,2007,98(5)：1000-1005.

［9］Ballez JS,Mols J,Burteau C,et al.Plant protein hydrolysates support CHO-320 cells proliferation and recombinant IFN-gamma production in suspension and inside microcarriers in protei-free media[J].Cytotechnology,2004,44(3)：103-114.

［10］趙麗麗,劉忠,程凡亮,等.重組CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研制[J].中國生物制品學(xué)雜志,2014,27(7)：910-913.

［11］張大鶴,易小萍,張元興,等.適于重組CHO細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基的制備[J].中國生物制品學(xué)雜志,2011,24(10)：1152-1156.

［12］劉國慶,陳飛,趙亮,等.表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞無蛋白培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].高?；瘜W(xué)工程 報,2013,27(1)：96-101.

［13］Bulter M.Animal cell cultures：recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals[J].Appl Microbiol Biotechnol,2005,68(3)：283-291.

［14］Jagschies G.Where is biopharmaceutical manufacturing heading[J].Biopharm Int,2008,21(10)：72-88.

［15］劉興茂,劉紅,葉玲玲,等.CHO工程細(xì)胞(11G-S)懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基的設(shè)計[J].生物工程學(xué)報,2010,26(8)：1116-1122.

［16］郭紀(jì)元.CHO DG44穩(wěn)定細(xì)胞株無血清培養(yǎng)基的研發(fā)與優(yōu)化[D].廈門大學(xué),2014.

［17］孫亞婷.DHER-CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)過程的開發(fā)與優(yōu)化[D].華東理工大學(xué),2013.

［18］謝奎.CHO細(xì)胞在Tubespin中的培養(yǎng)工藝及其代謝分析[D].暨南大學(xué),2011.

［19］Zhang HF,Wang HB,Liu M,et al.Rational development of a serum-free mediumand fed-batch process for a GS-CHO cell line expressing recombinant antibody[J].Cytotechnology,2013,65：363-378.

［20］de la Luz-Hernández KR,?Rojas-del Calvo L,?Rabasa-Legón Y,et al.Metabolic and proteomic study of NS0 myeloma cell line following the adaptation to protein-free medium[J].J Proteomics,2008,71(2)：133-147.