用于RNA干擾研究的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的條件優(yōu)化

姚瓊，董易之，徐淑，徐海明，陳炳旭

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東廣州510640)

1998年 Fire等［1］將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈 RNA(正義RNA(sense RNA)和反義RNA(anti-sense RNA))注射到線(xiàn)蟲(chóng)Caenorhabditis elegans體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)兩者都能夠特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)了特異性的基因沉默(gene silencing)，該小組將此現(xiàn)象稱(chēng)為RNA干涉(RNA interference，簡(jiǎn)稱(chēng)RNAi)。目前，RNAi技術(shù)已在多種模式生物如線(xiàn)蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)、果蠅 (Drosophila melanogaster)、小鼠(moth)等體內(nèi)實(shí)現(xiàn)，通常是用dsRNA(double-stranded RNA)介導(dǎo)基因沉默作用，dsRNA作為RNAi作用的前導(dǎo)物質(zhì)，對(duì)于干擾作用的發(fā)生起著決定性作用［2-4］。以dsRNA為基點(diǎn)研究基因沉默的分子機(jī)制成為熱點(diǎn)［5］。

在線(xiàn)蟲(chóng)C.elegans中，只需導(dǎo)入少量的dsRNA即可實(shí)現(xiàn)高效的RNAi效果，但哺乳動(dòng)物和果蠅中不存在RNAi的放大機(jī)制，即導(dǎo)入dsRNA后產(chǎn)生的RNAi作用不持久，具有瞬時(shí)性［6-7］。為了克服此缺點(diǎn)，研究者發(fā)展了基于DNA載體在動(dòng)植物體內(nèi)表達(dá)dsRNA的技術(shù)。這種載體可以是質(zhì)粒，也可以是病毒，甚至可以是DNA片段［8-9］。先在體外構(gòu)建能表達(dá)dsRNA的載體，再將載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)合成dsRNA，不但能增加有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞的種類(lèi)，而且在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞株中，dsRNA能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，省時(shí)省力且高效［10-11］。因此，應(yīng)用合適的表達(dá)載體表達(dá)dsRNA，對(duì)于采取喂食法和注射法實(shí)現(xiàn)的RNAi試驗(yàn)起著至關(guān)重要的作用。

由于質(zhì)粒L4440作為表達(dá)載體具有含有雙向T7強(qiáng)啟動(dòng)子，載體本身具有氨芐抗性，便于篩選等優(yōu)點(diǎn)，目前已成功用于多種RNAi試驗(yàn)所需dsRNA的表達(dá)［12-13］。在干擾載體構(gòu)建完成后克隆至大腸桿菌HT115(DE3)中，該菌含有T7 RNA聚合酶基因(λDE3 lysogen)，它可在T7啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生T7 RNA聚合酶。而且該菌有一個(gè)rnc基因突變，它是編碼特異性降解dsRNA的內(nèi)切酶RNaseⅢ的基因，有利于dsRNA的生成，這樣在IPTG誘導(dǎo)下在E.coli內(nèi)很容易產(chǎn)生dsRNA，另外，該菌為四環(huán)素抗性，轉(zhuǎn)入載體后具有雙抗性，便于篩選［14-15］。因此，該表達(dá)系統(tǒng)的成功構(gòu)建，可以快速經(jīng)濟(jì)地利用喂食法或注射法RNAi進(jìn)行生物體某個(gè)基因功能的研究。

dsRNA作為RNAi作用的前體分子，在生物體中合適量的dsRNA對(duì)RNAi的效果起到了很重要的作用，而大腸桿菌又是用于表達(dá)外源基因的較好載體［12］。因此，利用大腸桿菌大量表達(dá)RNAi試驗(yàn)所需的dsRNA并進(jìn)一步優(yōu)化其表達(dá)條件是必要的。筆者利用帶有空載質(zhì)粒L4440及重組質(zhì)粒LSA3的表達(dá)工程菌HT115(DE3)，借助正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其表達(dá)dsRNA的條件(例如誘導(dǎo)溫度、時(shí)間等)，便于后續(xù)的以喂食法或注射法介導(dǎo)的RNAi在靶標(biāo)生物體內(nèi)的實(shí)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 載體與菌株 菌株:HT115(DE3)，美國(guó)斯坦福大學(xué)Fire教授贈(zèng)送(美國(guó)國(guó)家線(xiàn)蟲(chóng)遺傳學(xué)研究中心提供)。

質(zhì)粒L4440:美國(guó)斯坦福大學(xué)Fire教授贈(zèng)送(美國(guó)麻省Addgene機(jī)構(gòu)提供)。

有外源基因插入的質(zhì)粒LSA3:在空載質(zhì)粒L4440中插入甜菜夜蛾(spodoptera exigua)幾丁質(zhì)合成酶A的一段長(zhǎng)度為450 bp基因片段，該重構(gòu)質(zhì)粒由中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑 蛋白胨(peptone)、酵母粉(yeast extract)購(gòu)自O(shè)xoid公司產(chǎn)品;氨芐青霉素(ampcillin)、四環(huán)素(Tetracycline)購(gòu)自廣州威佳科技有限公司;DNA markerIII購(gòu)自NEB公司;IPTG購(gòu)自Merck公司;DEPC購(gòu)自AMRESCO公司;Trizol購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;氯仿、異丙醇、乙醇及其他常用的化學(xué)試劑購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 目的基因在工程菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.3.1.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)外源基因的主要影響因素為誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度，采用L9(34)正交試驗(yàn)表(表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.3.1.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)。在2塊分別含LSA3、L4440質(zhì)粒的大腸桿菌平板上，用無(wú)菌牙簽挑取一些白色菌落，分別接種到 3 ml LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/ml Amp、12.5 μg/ml Tet)中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)12～14 h，活化。然后以1∶50轉(zhuǎn)接至2×YT培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4左右時(shí)，按試驗(yàn)號(hào)加入相應(yīng)濃度IPTG，并根據(jù)各試驗(yàn)號(hào)所需的條件誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間及溫度。

1.3.2 菌體RNA的提取及檢測(cè)。菌體RNA抽提采用傳統(tǒng)的Trizol提取法，并在該方法上稍作調(diào)整。

RNA質(zhì)量檢測(cè)手段包括瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和分光光度計(jì)測(cè)定。稱(chēng)取0.2 g Agrose溶于1×TAE緩沖液中，定容至20 ml，制成1%的電泳膠。將5 μl RNA樣品與1 μl 6×Loading Buffer充分混合后電泳檢測(cè)。將2 μl RNA樣品與498 μl DEPC水混勻(放大250倍)，利用分光光度計(jì)檢測(cè)，記錄樣品的OD260、OD260/OD280及RNA濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌富集量直觀(guān)對(duì)比 試驗(yàn)組與對(duì)照組組間對(duì)比:根據(jù)3次重復(fù)中菌液富集量情況，LSA3組與L4440組菌量無(wú)明顯差異。試驗(yàn)組與對(duì)照組組內(nèi)對(duì)比:直觀(guān)上看，L4440組與LSA3組都存在一個(gè)現(xiàn)象，即25℃培養(yǎng)條件下富集得到的菌量普遍比30℃、37℃這2種培養(yǎng)條件下的菌量少，但30℃與37℃條件下培養(yǎng)所得到的菌液濃度無(wú)明顯差異。

2.2 菌體RNA的提取及RNA純度檢測(cè) 對(duì)3次重復(fù)所抽提的菌體RNA利用分光光度計(jì)檢測(cè)其純度，結(jié)果顯示，3次重復(fù)中所抽提的RNA純度較好，2個(gè)組OD260/OD280在1.7～2.00的樣品比例都為88.9%，說(shuō)明樣品很少蛋白污染，且沒(méi)有RNA水解成單核苷酸的現(xiàn)象。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，3個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響大小依次為A、B、C。即對(duì)于大腸肝菌HT115(DE3)生長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間的作用最大，其次是誘導(dǎo)溫度，最后是誘導(dǎo)劑IPTG的濃度。

方差分析結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果的影響并不顯著，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果有一定影響，而另外2個(gè)因素誘導(dǎo)時(shí)間與誘導(dǎo)劑濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不明顯。

最佳組合為A3B2C3，即誘導(dǎo)時(shí)間8 h，誘導(dǎo)溫度30℃，誘導(dǎo)劑濃度10.0 mmol/L。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

先在體外構(gòu)建能表達(dá)dsRNA的載體，再將載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)合成dsRNA，可保證在細(xì)胞株中長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)dsRNA，有效發(fā)揮RNAi阻斷基因的效應(yīng)［15-16］。該試驗(yàn)選用E.coliHT115(DE3)(具有四環(huán)素抗性)作為材料，轉(zhuǎn)入含對(duì)應(yīng)目標(biāo)片段dsRNA的cDNA載體L4440(具有氨芐抗性)后具有雙抗性，便于篩選，這在IPTG誘導(dǎo)下在E.coli內(nèi)很容易產(chǎn)生dsRNA。

大腸肝菌表達(dá)外源基因的影響因素很多，該試驗(yàn)選用影響較大的幾項(xiàng):誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間。因?yàn)楣こ叹磉_(dá)外源基因的條件因基因不同也相應(yīng)不同，因此設(shè)定了這3個(gè)影響因素的3個(gè)水平以期得到E.coliHT115(DE3)表達(dá)目的基因的最優(yōu)條件。而試驗(yàn)組LSA3收菌量略小于空白對(duì)照組L4440，可能的原因是:外源基因的存在對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定影響。25℃培養(yǎng)條件下富集得到的菌量普遍比30℃、37℃這2種培養(yǎng)溫度下的菌量少，但30℃與37℃溫度下培養(yǎng)得到的菌量差別不大，造成這一現(xiàn)象可能的原因是工程菌E.coliHT115(DE3)的生長(zhǎng)受溫度影響較大，25℃并不是其適宜生長(zhǎng)溫度，其生長(zhǎng)最適溫度是30～37℃。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種解決多因素優(yōu)化問(wèn)題的卓有成效的方法［17-20］。該試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了dsRNA在HT115(DE3)內(nèi)的最優(yōu)表達(dá)條件。結(jié)果表明，最適合工程菌E.coliHT115(DE3)生長(zhǎng)并表達(dá)dsRNA的最佳組合為A3B2C3，即誘導(dǎo)時(shí)間8 h、誘導(dǎo)溫度30℃，誘導(dǎo)劑濃度10.0 mmol/L。

［1］FIRE A，XU S Q，MONTGOMERY M K，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391(6669):806-811.

［2］ GRISHOK A.RNAi mechanisms inCaenorhabditis elegans［J］.FEBS Letters，2005，579(26):5932-5939.

［3］徐俊，毛穎，苗荻，等.RNA干擾技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)世界，2012，12(3):15-17.

［4］TIMMONS L，F(xiàn)IRE A.Specific interference by ingested dsRNA［J］.Nature，1998，395(6705):853-854.

［5］FELLMANN C，LOWE S W.Stable RNA interference rules for silencing

［J］.Nat Cell Biol，2014，16(1):8-10.

［6］AHMET M D，HANNON G J.RNAi:An ever-growing puzzle［J］.Biochemical Sciences，2003，28(4):196-201.

［7］FIRE A.RNA-triggered gene silencing［J］.Trends Genet，1999，15(9):358-363.

［8］RAVI S K，MARTINEZ-CAMPOS M，ZIPPERLEN P，et al.Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA inCaenorhabditis elegans［J］.Genome Biology，2000，2(1):1-10.

［9］PHILLIP A N，PETER W R，F(xiàn)RANCESC C，et al.Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians［J］.PNAS，2003，100(1):861-865.

［10］顏懷城.RNA干擾的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥業(yè)，2006，15(16):4-6.

［11］FRASER A G，KAMATH R S.Functional genomic analysis ofC.eleganschromosome I by systematic RNA interference［J］.Nature，2000，408(10):325-330.

［12］TIMMONS L，COURT D L，F(xiàn)IRE A.Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference inCaenorhabditis elegans［J］.Gene，2001，263(1/2):103-112.

［13］CARTHEW R W.Gene silencing by double-stranded RNA［J］.Curr Opin Cell Biol，2001，13(2):244-248.

［14］HAMMOND S M，CAUDY A A.Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA［J］.Nat Rev Genet，2001，2(2):110-119.

［15］TENLLADO F，MARTINEZ-GARCIA B，VARGAS M，et al.Crude extracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections［J］.BMC Biotechnology，2003，3(3):1472-1570.

［16］G·J·漢農(nóng).RNAi——基因沉默指南［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:1-104.

［17］王懷亮，趙海水.用正交實(shí)驗(yàn)法選擇制備黃腐酸的最佳條件［J］.腐植酸，1999，1(2):28-40.

［18］唐春紅，蔡紹皙.一種在生物醫(yī)學(xué)工程科研中有實(shí)用價(jià)值的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法-均勻設(shè)計(jì)與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)聯(lián)用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2006，23(6):28-31.

［19］李皓，唐新軍.逐次正交設(shè)計(jì)優(yōu)化法［J］.長(zhǎng)江科學(xué)院院報(bào)，1996，9(13):37-39.

［20］杜榮騫.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］.北京:高等教育出版社，2003:241-286.