活血祛風(fēng)法對咳嗽變異性哮喘模型大鼠肺組織Caspase3的影響*

張晶潔徐榮謙孫洮玉倪玉婷朱洧儀

（1.北京市昌平區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京102208；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700）

·研究報告·

活血祛風(fēng)法對咳嗽變異性哮喘模型大鼠肺組織Caspase3的影響*

張晶潔1徐榮謙2△孫洮玉2倪玉婷2朱洧儀2

（1.北京市昌平區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京102208；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700）

目的觀察活血祛風(fēng)法對咳嗽變異性哮喘（CVA）模型大鼠肺組織半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）的影響。方法將Wistar大鼠48只按隨機數(shù)字表法分為模型組、正常組、西藥組、中藥高、中、低劑量組6組，每組8只。采用卵蛋白與氫氧化鋁溶液注射、霧化等綜合方法復(fù)制CVA大鼠模型，造模成功后各用藥組分別給予中藥及西藥進行干預(yù)，正常組及模型組給予羧甲基纖維素鈉（CMC）干預(yù)，治療4周后處死大鼠，進行取材。各組大鼠HE染色觀察氣道病理改變，免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠肺組織內(nèi)Caspase3表達水平。結(jié)果模型組肺組織炎癥、水腫程度較正常組明顯加重；與模型組相比，各用藥組則均有改善。模型組大鼠Caspase3在肺中表達明顯高于正常組（P＜0.05），而西藥組，中藥高、中、低劑量組Caspase3的表達則明顯低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論以活血祛風(fēng)法立法的加味芎蝎散可緩解CVA大鼠肺組織炎癥以及降低其肺組織內(nèi)Caspase3的表達，起到抑制氣道上皮細胞凋亡來減少氣道上皮損傷，可能是加味芎蝎散作用機制之一。

活血祛風(fēng)法咳嗽變異性哮喘細胞凋亡Caspase3

咳嗽變異性哮喘（CVA）臨床主要表現(xiàn)為刺激性的干咳，很少出現(xiàn)喘息和呼吸困難；大多數(shù)患兒有個人或家族過敏史；臨床無感染征象，或經(jīng)長時間抗生素治療無效；肺功能檢測以及查體常常無異常；支氣管擴張劑可使病情得到緩解［1］。由于本病具有獨特的臨床表現(xiàn)“只咳不喘”，并且許多兒科醫(yī)生對本病認(rèn)識不足，極易造成誤診、漏診。有報道指出本病的誤診率可達82.5%［2］；兒童時期的CVA是發(fā)展為典型哮喘的一個危險因素［3］。近年來，中醫(yī)藥治療兒童CVA取得了較好的臨床療效，并且進行了更加深入的臨床研究。但是，目前研究中醫(yī)藥治療CVA也存在一些問題，尤其在探討作用機制方面研究相對較少。本研究采用以活血祛風(fēng)立法的加味芎蝎散為干預(yù)手段，與西藥順爾寧進行對比研究，觀察其對CVA模型大鼠肺組織半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）表達的影響，探討其治療CVA的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量90～100 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXX（京）2006-0009。

1.2試劑與藥品1）試劑。卵清蛋白（OVA），Sigma公司生產(chǎn)，批號A5378。氫氧化鋁，上海美興化工股份有限公司生產(chǎn)，批號100801。大鼠Caspase3兔多克隆抗體，購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒、濃縮型DAB試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。2）藥品。加味芎蝎散配方顆粒主要藥物組成：川芎10 g，全蝎5 g，蓽茇1 g，細辛1 g，清半夏6 g，桃仁10 g，當(dāng)歸10 g，白前10 g，五味子10 g，蘆根15 g（東直門醫(yī)院制劑室提供）。孟魯司特鈉片（順爾寧），杭州默沙東制藥有限公司，批號100487。

1.3模型制備參照文獻［4］進行造模。除正常組外，余下各組大鼠，第1日肌注4%OVA溶液0.5mL，同時腹腔注射2%Al（OH）30.2mL。第15日，用1%OVA溶液進行霧化，隔日1次，共7次。

1.4分組及給藥將48只大鼠按隨機數(shù)字表法分為6組，包括模型組、西藥組、中藥高、中、低劑量組，每組8只，均予以造模；正常組8只，不予以造模。但與其余各組同步飼養(yǎng)觀察。造模后，正常組、模型組予以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC）灌胃。西藥以及中藥配方顆粒于實驗前用0.5%CMC配制成溶液。西藥組予以順爾寧混懸液按1.3 mg/（kg·d）灌胃；中藥高、中、低劑量組予以中藥混懸液按照［5.47、2.74、1.37 g/（kg·d）］劑量灌胃。每日1次，連續(xù)4周。給藥容量均為1 mL（100 g·d）。

1.5觀察項目1）肺組織病理改變觀察。給藥4周后，各組大鼠以10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）腹腔麻醉。剪取大鼠右上葉肺組織置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。HE染色，顯微鏡下觀察病理改變。2）肺組織Caspase3表達測定。采用兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒測定大鼠右上葉肺組織Caspase3的表達。按照試劑盒說明書操作。采用日本OLYMPUS顯微鏡采集圖像，每張切片在高倍鏡下（400倍）至少選取3個不重疊視野。然后用Image-Pro Plus軟件對圖像進行分析，計算出陽性表達面積占待測總面積的百分比，取平均值，得出該動物肺組織中Caspase3值。1.6統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組肺組織病理變化見圖1。正常組大鼠肺組織偶見炎性細胞浸潤，管腔通暢，管壁結(jié)構(gòu)完整無破壞，黏膜無充血及水腫。與正常組比較，模型組大鼠肺組織有大量炎性細胞浸潤，淋巴組織增生，支氣管壁及肺泡隔均增厚、水腫，肺泡腔內(nèi)有脫落的上皮細胞。與模型組比較，西藥組、中藥各劑量組炎性細胞浸潤明顯減少，水腫程度減輕。中藥各劑量組與西藥組比較病理變化無明顯差異。

圖1　各組肺組織病理變化（HE染色，×400）

2.2各組肺組織Caspase3的測定見表1。模型組肺組織中Caspase3表達升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中藥各劑量組、西藥組肺組織中Caspase3表達降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3　討論

CVA被認(rèn)為是有喘息和呼吸困難癥狀的典型哮喘的變異形式。目前CVA的發(fā)病機制尚不十分清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CVA也是一種氣道慢性炎癥性疾病，并且是典型哮喘的前期階段，其發(fā)病機制、病理改變也與典型哮喘非常相似，只是嚴(yán)重程度不同［5-6］。

The Effect of Promoting Blood Circulation and Expelling Wind on Lung Tissue Caspase3 in Rats with CVA

ZHANG Jingjie，XU Rongqian，SUN Taoyu，et al.

Changping Hospital of Integrated TCM&WM，Beijing 102208，China

Objective：To explore the effect of promoting blood circulation and expelling wind on lung tissue Caspase3 in Rats with CVA.Methods：Forty eight Wistar rats were randomly divided into six groups（n＝8）：the model group，the control group，the western medicine group，and the herbal medicine groups with high，medium and low doses.The rats were injected and inhaled with OVA and aluminum hydroxide solution to make CVA model rats.Then the western medicine group and the herbal medicine groups with high，medium and low doses were intervened by western medicine and herbal medicine；the control group and model group were given CMC for four weeks.After the rats were killed，lung tissue was drawn from rats with CVA.Pathological changes of airway of rats were observed with HE.Caspase3 expression in lung tissue was investigated by means of immunohistochemical method.Results：The inflammation edemas of lung tissue increased in the model group.Compared with the model group，there was significant difference between the treatment group and the control group.The Caspase3 expression increased in lung tissue in the model group，compared with the control group.Compared with the model group，the results indicated that Caspase3 expression level decreased in the western medicine group and the herbal medicine groups with high，medium and low doses（all P＜0.05）.Conclusion：Jiawei Xiongxie San by promoting blood circulation and expelling wind can relieve inflammation and reduce expression of Caspase3 in lung tissue of the CVA model rats，reducing epithelial injury of airway by inhibiting airway epithelial cell apoptosis，which may be one of the important mechanisms for treatment of CVA.

Promoting blood circulation and expelling wind method；Cough variant asthma；Apoptosis；Caspase3

R285.5

A

1004-745X（2015）10-1708-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.006

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（20100013110013）；北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展資金項目（QN2013-20）

（電子郵箱：xurongqian1950@163.com）