艾蒿精油的抑菌活性和穩(wěn)定性

段偉麗，劉艷秋，包怡紅*，2

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江哈爾濱150040）

艾蒿精油的抑菌活性和穩(wěn)定性

段偉麗1，劉艷秋1，包怡紅*1，2

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江哈爾濱150040）

采用濾紙片法測(cè)定艾蒿精油的抑菌活性，平板涂布法測(cè)定其最低抑菌濃度（MIC）；同時(shí)研究了艾蒿精油抑菌活性的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性，以及殼聚糖、CaCl2、NaCl對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響。結(jié)果表明：艾蒿精油對(duì)3種受試菌的抑制效果有較大差異，對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用較弱；精油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的MIC分別為2.5、5、10滋L/mL。艾蒿精油具有良好的紫外穩(wěn)定性；溫度和pH對(duì)艾蒿精油的抑菌效果影響較大，溫度低于40℃時(shí)抑菌活性較好，高于40℃，則抑菌活性逐漸下降；酸性條件下可增強(qiáng)艾蒿精油的抑菌活性。殼聚糖、CaCl2、NaCl均可增加艾蒿精油的抑菌效果，且殼聚糖、CaCl2對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響大于NaCl。

艾蒿精油；抑菌活性；穩(wěn)定性

為了防止食品腐敗變質(zhì)，常常在食品中添加保鮮劑［1］。植物精油作為天然源保鮮劑的重要來源，以直接接觸或熏蒸的方式在食物周圍形成抑菌氛圍而達(dá)到防腐保鮮［2-4］。Mohammad J等［5］發(fā)現(xiàn)牛至精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%即可對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等有明顯的抑制作用。

艾蒿，學(xué)名艾（Artemisia argyi Levl.et Vent），俗稱大艾、生艾、月艾等，為菊科蒿屬多年生草本植物或半灌木，植株有濃烈香氣，具有抗菌消炎、抗病毒、平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗過敏、止血和抗凝血、增強(qiáng)免疫功能等作用［6］，還可作為天然整理劑對(duì)織物進(jìn)行抗菌防臭的整理。因其獨(dú)特的芳香氣味和生物活性，廣泛應(yīng)用于食品保鮮、驅(qū)蟲、醫(yī)藥、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域［7］，開發(fā)和應(yīng)用前景十分廣闊。作者就艾葉精油對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用進(jìn)行研究，旨在尋求一種綠色安全、無污染的食品保鮮劑，也為艾蒿精油的綜合開發(fā)利用提供全新的途徑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

艾蒿精油通過水蒸氣蒸餾法提取，由作者所在實(shí)驗(yàn)室自制。

大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），枯草桿菌（Bacillus subtilis），所有供試菌種均來源于東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂18 g/L，蒸餾水1 000 mL；pH 7.2～7.4。

吐溫-80，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供。

1.2儀器與設(shè)備

水蒸氣蒸餾裝置，作者所在實(shí)驗(yàn)室固有設(shè)備；高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司制造；電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司制造；恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司制造；還有實(shí)驗(yàn)室自備超凈工作臺(tái)、移液槍等。

1.3方法

1.3.1精油的制備配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的吐溫-80溶液，滅菌，用吐溫-80溶液稀釋精油至體積分?jǐn)?shù)為25%，混勻。

1.3.2菌懸液的制備從經(jīng)過活化2～3次的菌體斜面上挑取一環(huán)菌體接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，使用平板計(jì)數(shù)法調(diào)整濃度為106～107cfu/mL，備用［8］。

1.3.3抑菌圈的測(cè)定采用濾紙片法測(cè)定艾蒿精油對(duì)3種供試菌的抑菌活性。用打孔器制直徑為6 mm的圓濾紙片，滅菌，備用。在無菌環(huán)境下，向已滅菌的培養(yǎng)皿中倒入培養(yǎng)基15～20 mL，冷卻。取各種待測(cè)菌懸液100滋L，分別涂布在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，涂抹均勻，制成含菌平板。取濾紙片貼在含菌平板上，每皿3片，每片濾紙上滴加10滋L艾蒿精油溶液，以吐溫-80做對(duì)照，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h。平行3次，交叉法測(cè)量抑菌直徑，取平均值。

1.3.4最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定試管滅菌，編號(hào)，每管加入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，采用二倍稀釋法配制一系列梯度的精油溶液，使最終精油體積分?jǐn)?shù)范圍在0.625～40滋L/mL，每個(gè)試管中再加入50滋L含菌濃度為106～107cfu/mL的菌懸液。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的吐溫-80溶液為對(duì)照，37℃培養(yǎng)24 h，每管取100滋L涂布，培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長狀況，以平板無細(xì)菌生長的精油體積分?jǐn)?shù)作為最低抑菌濃度。

1.3.5抑菌活性熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將體積分?jǐn)?shù)25%的精油分別置于20、40、60、80、100℃熱處理15 min，冷卻到室溫，滴加菌懸液100滋L于平板制成含菌平板，取3個(gè)直徑6 mm的濾紙片貼于含菌平板表面，每個(gè)濾紙片滴加精油溶液10滋L，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察熱處理對(duì)艾蒿精油抑菌活性的影響。

1.3.6抑菌活性酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaOH溶液和體積分?jǐn)?shù)50%的檸檬酸分別將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80的pH調(diào)為3、4、5、6、7、8、9、10，再將精油稀釋至體積分?jǐn)?shù)25%，配制相同體積分?jǐn)?shù)不同pH的精油溶液。滴加菌懸液100滋L于平板制成含菌平板，取3個(gè)直徑6 mm濾紙片貼于含菌平板表面，每個(gè)濾紙片滴加精油溶液10滋L，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，比較pH對(duì)精油抑菌活性的影響。

1.3.7抑菌活性紫外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)體積分?jǐn)?shù)25%的精油紫外燈各處理10、20、30、40、50、60 min。滴加菌懸液100滋L于平板中制成含菌平板，取3個(gè)直徑為6 mm的濾紙片貼于含菌平板表面，每個(gè)濾紙片滴加精油溶液10滋L，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定紫外線照射對(duì)艾蒿精油抑菌活性的影響。

1.3.8殼聚糖對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響將殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)1%醋酸溶液，配制不同質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液，調(diào)節(jié)pH至5.4。將艾蒿精油用少量吐溫-80溶液乳化，加入殼聚糖溶液中，得到艾蒿精油體積分?jǐn)?shù)相同、殼聚糖質(zhì)量濃度不同（0.25、0.5、1、2、3 g/dL）的溶液。將不同殼聚糖質(zhì)量濃度的精油溶液分別滴加10滋L在相應(yīng)平板的濾紙片上，以不含艾蒿精油的殼聚糖溶液為對(duì)照組，按照1.3.3的方法測(cè)殼聚糖對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響。

1.3.9CaCl2對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響取適量CaCl2溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80水溶液中，得到不同質(zhì)量濃度的CaCl2溶液。加入少量精油，配制艾蒿精油體積分?jǐn)?shù)相同、CaCl2質(zhì)量濃度不同（0.25、0.5、1、2、3 g/dL）的溶液，以不加艾蒿精油的CaCl2溶液為對(duì)照組，按照1.3.3的方法測(cè)定CaCl2對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響。

1.3.10NaCl對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響取適量NaCl溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80水溶液中，得到不同質(zhì)量濃度的NaCl溶液。加入少量精油，配制艾蒿精油體積分?jǐn)?shù)相同、NaCl質(zhì)量濃度不同（0.25、0.5、1、2、3 g/dL）的溶液，以不含艾蒿精油的NaCl溶液為對(duì)照組，按照1.3.3的方法測(cè)定NaCl對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1艾蒿精油的抑菌活性

采用濾紙片法研究艾蒿精油的抑菌活性，結(jié)果見表1，艾蒿精油對(duì)3種供試菌均有抑制作用，抑菌活性排序?yàn)椋簩?duì)金黃色葡萄球菌>對(duì)枯草芽孢桿菌>對(duì)大腸桿菌。對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌的抑制作用較弱，表明其對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)革蘭氏陰性菌。研究表明，對(duì)于植物精油的抑菌效果，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更為敏感，這是因?yàn)楦锾m氏陰性菌細(xì)胞壁外側(cè)含有一層脂多糖，能夠阻止疏水性的化合物進(jìn)入到菌體細(xì)胞體內(nèi)，從而降低了抑菌效果。

表1　艾蒿精油對(duì)不同菌種的抑菌活性Table 1Antimicrobial activities of essential oil from Artemisia argyi against 3 tested microbes

2.2最低抑菌體積分?jǐn)?shù)

由于不同菌種對(duì)艾蒿精油的敏感程度不同，最低抑菌體積分?jǐn)?shù)也各不相同，結(jié)果見表2。當(dāng)精油體積分?jǐn)?shù)僅為2.5滋L/mL時(shí)，平板上就無金黃色葡萄球菌落出現(xiàn)，而枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最低抑制體積分?jǐn)?shù)分別為5、10滋L/mL?？梢?，極少量的精油即可抑制細(xì)菌生長，實(shí)用成本可極大降低。

表2　艾蒿精油對(duì)供試菌的MICTable 2MICs of essential oil from Artemisia argyi against 3 tested microbes

2.3艾蒿精油抑菌效果的熱穩(wěn)定性

不同溫度的熱處理對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響結(jié)果見圖1。

圖1　熱處理對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響Fig.1Antibacterialactivitiesofessentialoilfrom Artemisia argyi at different temperatures against 3 tested microbes

可知，低于40℃時(shí)，艾蒿精油對(duì)3種供試菌保持良好的抑制活性；高于40℃時(shí)，精油對(duì)供試菌的抑菌圈直徑大幅度下降，100℃時(shí)抑菌作用非常弱。表明，艾蒿精油在40℃以上的環(huán)境中抑菌成分逐漸揮發(fā)，抑菌效果的熱穩(wěn)定性較差，達(dá)到100℃時(shí)，抑菌成分含量極少，因而抑菌圈明顯縮小。但在實(shí)際應(yīng)用過程中，用于食品的保鮮溫度均小于40℃，所以并不影響艾蒿精油的應(yīng)用。

2.4艾蒿精油抑菌效果的酸堿穩(wěn)定性

不同pH處理對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響結(jié)果見圖2。

圖2　pH對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響Fig.2Antibacterialactivitiesofessentialoilfrom Artemisia argyi at different pH values against 3 tested microbes

質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80溶液的自然pH約為5。由圖2可知，pH在6～7時(shí)，隨著pH的增加抑菌圈直徑反而減?。籶H大于7時(shí)，其抑菌能力又有所提高；pH大于9時(shí)，抑菌能力稍有下降。這與李婭男等［9］人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，原因是在酸性環(huán)境下，不僅細(xì)菌本身的活性降低，還可以降低精油中酚類化合物上所帶的酚羥基的電離度，使其疏水性增加，更易溶于細(xì)菌細(xì)胞膜的脂相和蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域，與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合能力更強(qiáng)［10］；pH>7時(shí)抑菌能力提高的原因可能是堿性條件抑制了細(xì)菌的生長。所以，在酸性條件下艾蒿精油的抑菌活性增強(qiáng)。

2.5艾蒿精油抑菌效果的紫外穩(wěn)定性

紫外線照射不同時(shí)間對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響結(jié)果見圖3。

可見，隨著紫外照射時(shí)間的增加，艾蒿精油對(duì)供試菌的抑菌活性基本不發(fā)生變化，這與劉玉民等［11］人的研究結(jié)果相同。表明，艾蒿精油具有良好的紫外穩(wěn)定性，其成分結(jié)構(gòu)與活性不受紫外線的影響。

圖3　紫外線對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響Fig.3Antibacterialactivitiesofessentialoilfrom Artemisia argyi under ultraviolet irradiation for different time

2.6殼聚糖對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響

由圖4可知，殼聚糖可增強(qiáng)艾蒿精油的抑菌效果，殼聚糖質(zhì)量濃度低于1 g/dL時(shí)，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，艾蒿精油對(duì)3種供試菌的抑菌圈直徑顯著增加，金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑增加速度較枯草芽孢桿菌、大腸桿菌慢；殼聚糖質(zhì)量濃度高于1 g/dL，3種供試菌的抑菌圈直徑變化不明顯。

圖4　殼聚糖對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響Fig.4Effect of Chitosan on the antibacterial activities of essential oil from Artemisia argyi

從圖5可以看出，殼聚糖本身具有抑菌活性，單獨(dú)使用時(shí)即可對(duì)供試菌產(chǎn)生明顯的抑制作用，與艾蒿精油聯(lián)合使用可顯著提高其抑菌效果。殼聚糖的聚陽離子與微生物帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞發(fā)生形變、泄露，還可與DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，阻礙DNA的合成［12-14］。通常，殼聚糖是采用涂膜的方式對(duì)果蔬進(jìn)行保鮮，可有效降低果蔬的腐爛和水分的散失。

2.7CaCl2對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響

由圖6、圖7可見，CaCl2單獨(dú)使用時(shí)對(duì)供試菌均有抑制作用，但質(zhì)量濃度增加，抑菌圈直徑變化不顯著；與艾蒿精油結(jié)合使用，對(duì)3種供試菌的抑菌圈直徑明顯增大，艾蒿精油對(duì)供試菌的抑菌效果隨CaCl2質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。CaCl2是一種電解質(zhì)，可破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖，使細(xì)胞壁通透性增大，導(dǎo)致細(xì)菌變形、裂解而亡［5，15］。

圖5　殼聚糖對(duì)供試菌的抑菌效果Fig.5Antibacterial activities of Chitosan against 3 tested microbes

圖6　CaCl2對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響Fig.6Effect of CaCl2on the antibacterial activities of essential oil from Artemisia argyi

圖7　CaCl2對(duì)供試菌的抑菌效果Fig.7Antibacterial activities of CaCl2against 3 tested microbes2.8NaCl對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響

不同質(zhì)量濃度的NaCl溶液對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響結(jié)果見圖8。

圖8　NaCl對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響Fig.8Effect of NaCl on the antibacterial activities of essential oil from Artemisia argyi

NaCl單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)供試菌幾乎沒有抑菌效果，但與艾蒿精油結(jié)合使用時(shí)，可增加艾蒿精油的抑菌效果。與殼聚糖、CaCl2對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響相比，NaCl質(zhì)量濃度增大，艾蒿精油對(duì)3種供試菌的抑菌圈直徑變化相對(duì)不明顯?？梢?，NaCl對(duì)艾蒿精油的抑菌效果的影響相對(duì)較小。一定質(zhì)量濃度的NaCl可影響細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外的離子梯度，改變細(xì)菌的代謝，最終導(dǎo)致菌體死亡［16］。研究表明，植物精油與NaCl結(jié)合使用應(yīng)用于果蔬保鮮，過低的NaCl質(zhì)量濃度不能增強(qiáng)植物精油的抑菌效果，但過高NaCl質(zhì)量濃度可能會(huì)對(duì)果蔬產(chǎn)生毒害作用，從而降低果蔬本身對(duì)細(xì)菌、真菌的抵抗力，甚至對(duì)細(xì)菌或真菌可能會(huì)起到一定的保護(hù)作用［17］。

3　結(jié)語

艾蒿精油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均有一定的抑制作用，抑制活性大小排序?yàn)閷?duì)金黃色葡萄球菌>對(duì)枯草芽孢桿菌>對(duì)大腸桿菌。艾蒿精油對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制活性強(qiáng)于對(duì)革蘭氏陰性菌。精油體積分?jǐn)?shù)僅為2.5滋L/mL時(shí)，即可完全抑制金黃色葡萄球菌的生長；精油體積分?jǐn)?shù)為5滋L/mL可完全抑制枯草芽孢桿菌的生長；而大腸桿菌則相對(duì)不敏感，精油體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10滋L/mL時(shí)才可完全抑制。艾蒿精油具有良好的紫外穩(wěn)定性。溫度和pH對(duì)艾蒿精油的抑菌效果影響較大，溫度低于40℃時(shí)抑菌活性較好，高于40℃抑菌活性逐漸下降；酸性條件下可增強(qiáng)其抑菌活性。殼聚糖、CaCl2、NaCl均可增加艾蒿精油的抑菌效果，但殼聚糖、CaCl2對(duì)艾蒿精油抑菌效果的影響大于NaCl。本研究結(jié)果對(duì)艾蒿精油的開發(fā)利用有一定的參考價(jià)值和理論意義。

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Study on Antimicrobial Activities and Stability of Essential Oil from Artemisia argyi

DUANWeili1，LIUYanqiu1，BAOYihong1，2
（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Collaborative Innovation Center for Development and Utilization of Forest Resources，Harbin 150040，China）

The filter Paper disk disffusion and spread-plate assay were used to determine the antimicrobial activity and minimum inhibitory concentration（MIC）of essential oil from Artemisia argyi.The effect of antimicrobial activity on stability of acid，base，heat and ultraviolet ray were studied.Results showed that the antimicrobial activitity of the essential oil from Artemisia argyi against three tested microbes were largely different.The essential oil showed strong antimicrobial effect against the Gram positive bacteria while weak effect against Gram negative bacteria.The MICs of the essential oil against Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，Escherichia coli were 2.5，5，10滋L/mL，respectively.The antimicrobial activities of the essential oil were stable under the ultraviolet ray，but were unstable under different temperatures and pH values.The acitivity was much better when the temperure below 40℃，and strong in acid and weak in base solution.Chitosan，CaCl2，NaCl can increase the antimicrobial activity，while Chitosan and CaCl2showed higher effect as compared to NaCl.

essential oil from Artemisia argyi，antimicrobial activity，stability

TS 201.3

A

1673—1689（2015）12—1332—06

2014-10-23

哈爾濱市科技廳留學(xué)歸國基N018）。

包怡紅（1970—），女，黑龍博士研究生導(dǎo)師，主要從事植物活性成分生物轉(zhuǎn)化和功能性食品的開發(fā)研究。E-mail：baoyihong@163.com