多重鏈接探針擴增技術(shù)的原理及應(yīng)用

史喜菊，郝俊虎，柏亞鐸，馬貴平，喬彩霞，劉全國，李炎鑫，李冰玲

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京　100026；2.寧夏出入境檢驗檢疫局，寧夏銀川　750001）

多重鏈接探針擴增技術(shù)的原理及應(yīng)用

史喜菊1，郝俊虎2，柏亞鐸1，馬貴平1，喬彩霞1，劉全國1，李炎鑫1，李冰玲1

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京100026；2.寧夏出入境檢驗檢疫局，寧夏銀川750001）

多重鏈接探針擴增技術(shù)是將核酸雜交和PCR鏈?zhǔn)綌U增相結(jié)合的一項高通量檢測技術(shù)。該技術(shù)特異性強、敏感性高，可以實現(xiàn)多達50個靶分子的同步檢測。自2002年被報道以來，該技術(shù)取得了很大進展，目前已廣泛用于遺傳性疾病的基因檢測、腫瘤預(yù)后及傳染病高通量檢測領(lǐng)域。本文就多重鏈接探針擴增技術(shù)的原理、優(yōu)缺點及應(yīng)用等進行了探討。

多重鏈接探針擴增技術(shù)；原理；應(yīng)用

多重鏈接探針擴增技術(shù)（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）最早是由荷蘭的Schouten博士于2002年發(fā)明的，是一種高通量、針對待測核酸中靶序列進行檢測和分析的新技術(shù)［1］。該技術(shù)僅需20 ng/μL模板DNA或RNA，即可通過簡單的探針雜交、連接及PCR擴增和電泳步驟，在同一反應(yīng)管中對多達50個不同的靶基因進行檢測和分析。該技術(shù)經(jīng)過短短幾年的發(fā)展，目前已經(jīng)在遺傳疾病、基因甲基化分析等多個領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用［2-3］。

1 MLPA的原理

MLPA技術(shù)是將核酸的雜交檢測和PCR鏈?zhǔn)綌U增相結(jié)合，從而實現(xiàn)多對靶分子的高效特異性分析。其核心技術(shù)是設(shè)計與目的靶序列高度特異性的長探針和短探針，發(fā)生MLPA反應(yīng)時，這兩段探針首先分別與模板序列雜交，之后通過連接酶將兩段探針進行連接。連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)兩個探針與靶序列完全雜交，即靶序列與探針特異性序列完全互補，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈；反之，如果靶序列與探針序列不完全互補，即使只有一個堿基的差別，就會導(dǎo)致雜交不完全，使連接反應(yīng)無法進行。長探針和短探針發(fā)生連接后，生成一條兩端分別含有上下游通用PCR引物的全長探針，并在通用引物的擴增之下，使模板成鏈?zhǔn)椒糯?，最后生成的PCR擴增產(chǎn)物通過毛細管電泳分離，再經(jīng)軟件分析［1］。

2 MLPA反應(yīng)步驟

圖1 MLPA反應(yīng)原理

2.1探針與靶序列雜交

在MLPA反應(yīng)中，一個目標(biāo)序列需要設(shè)計一對探針，包括長探針和短探針，短探針由兩段核苷酸組成，包括位于5'端的PCR通用正向引物序列和位于3'端的模板特異性序列；長探針由三段核苷酸組成，包括位于5’端的模板特異性序列和3’端的通用反向引物序列外，在兩者之間還添加了大小不等的填充序列（指紋序列），填充序列不是必須的，主要是用于區(qū)分擴增產(chǎn)物的大小。MLPA反應(yīng)時，首先將雙鏈DNA在98℃變性裂解，裂解為單鏈DNA，溫度降為60℃時長短探針分別與單鏈DNA過夜雜交［1-3］。

2.2探針的特異性連接

調(diào)節(jié)溫度降為54 ℃，加入連接酶。如果被檢核酸中含有靶序列，則長短探針可均與模板序列互補良好，連接反應(yīng)可以進行，長短探針可以連接為一條完整的核酸單鏈。若其中一條探針的序列與被檢靶基因序列不完全互補，即使只有一個堿基不互補，也會使雜交不完全而使連接反應(yīng)無法進行。這種連接是高度特異性的，保障了MLPA的高特異性優(yōu)勢［1-4］。

2.3PCR擴增

MLPA擴增的并不是被檢樣本核酸，而是上述連接生成的與靶序列結(jié)合的完整核酸探針，只要有一條完整的核酸單鏈生成了，PCR擴增反應(yīng)即可進行，這保證了MLPA技術(shù)的高靈敏性。連接反應(yīng)完成后，每一條完整的核酸單鏈5'端都帶有通用PCR正向引物，3'端都帶有通用PCR反向引物。由于事先給每種被檢基因的長探針加入了特定大小的指紋序列，每對探針的擴增產(chǎn)物的長度都是唯一的，在通用引物的擴增下，這些大小不同的擴增片段被同時擴增了出來，一般相鄰兩產(chǎn)物的長度差可以在10 bp之間，這樣可以同時檢測的基因數(shù)可高達50種不同靶基因［1-4］。

2.4毛細管電泳分析

PCR擴增產(chǎn)物可用瓊脂糖凝膠電泳分離分析，也可通過毛細管電泳等進行分離分析。但一般情況下由于多重擴增的不同片段之間相差較小，而且，擴增片段大小多集中于90～150之間效果較好，普通瓊脂糖凝膠電泳無法分離，建議使用毛細管電泳，再用相關(guān)軟件分析電泳結(jié)果［2，4］。

3 MLPA的優(yōu)缺點

MLPA作為一種新型檢測技術(shù)，具有如下優(yōu)點 ：1. 靈敏度高，所需樣本量小，最少僅需20 ng DNA即可完成檢測，檢測限可達3 000～6 000個靶分子；2. 多重分析，可同時檢測多達50檢測靶基因；3. 特異性強，檢測精準(zhǔn)度高，可以區(qū)分單個核苷酸不同，保證了檢測的特異性；4. 高通量，一個反應(yīng)可以同時檢測多種病原，有利于疫病的及時確診；5. 自動化程度高，在PCR結(jié)束之后直接可用毛細管電泳分析結(jié)果，操作易于標(biāo)準(zhǔn)化；6. 一次檢測可完成96個樣品的檢測［1-2］。

MLPA技術(shù)盡管有諸多優(yōu)點，但其畢竟是一種新技術(shù)，局限性特別是應(yīng)用方面的局限性是難免的：1.目前普及程度不高，試劑比較昂貴；2.探針設(shè)計比較困難耗時，不過一旦前期設(shè)計完成，后期的高通量檢測工作即容易進行；3. 由于需核酸雜交，操作比較繁瑣而且費時；4. 應(yīng)用受限制，目前更多的應(yīng)用還是基因突變和甲基化檢測，在其他領(lǐng)域進展緩慢。

4 MLPA的應(yīng)用

4.1用于檢測人類基因或基因片段的缺失或重復(fù)

人類很多遺傳性疾病都跟基因缺失或突變有關(guān)，因此MLPA多年來在基因遺傳性疾病的研究及臨床監(jiān)測中發(fā)揮了巨大應(yīng)用。如MLPA技術(shù)已用于遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌的鑒別以及卵巢癌和乳腺癌患者的預(yù)后等，也可用于多種遺傳病的基因定量研究，如苯丙酮尿癥，杰格斯綜合征及多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤等［5］。

4.2用于檢測由染色體異常引發(fā)的疾病

染色體重排常引發(fā)智力發(fā)育遲緩及其他多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。MLPA可以檢測出染色體重排或微小重排。已有多家實驗室對MLPA技術(shù)在檢測精神發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用進行研究，已報道的有Williams 綜合征、Sotos綜合征及Axenfeld-Rieger 綜合征等［3］。MLPA可以識別單個核苷酸的差異，因此可用于單核苷酸多態(tài)性和各種點突變的檢測。MLPA技術(shù)也可以檢測染色體數(shù)目的異常，如唐氏綜合征等。

4.3MLPA 在腫瘤檢測方面的應(yīng)用

大約30%的人類腫瘤基因組中存在DNA拷貝數(shù)異常，其中DNA拷貝數(shù)增加是癌基因激活的重要方式。由于MLPA技術(shù)可檢測出DNA拷貝數(shù)量的異常，因此已被應(yīng)用于多種腫瘤的檢測中。2003年，Eldering等［6］在MLPA技術(shù)基礎(chǔ)上建立了逆轉(zhuǎn)錄-MLPA（RT-MLPA），該技術(shù)改進能夠發(fā)現(xiàn)mRNA 低拷貝數(shù)變異。此外，細胞全基因組水平的低甲基化和局部區(qū)域關(guān)鍵基因的高甲基化也是腫瘤的基本特征，且其甲基化狀態(tài)的改變往往出現(xiàn)于細胞惡性增生早期，并隨惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展而變化。因此，檢測細胞甲基化狀態(tài)對腫瘤的預(yù)防、治療及觀察預(yù)后都有極其重大的意義。甲基化特異性MLPA（methylation-specific MLPA，MSMLPA）是一種由 MLPA 技術(shù)部分改進而成的可檢測基因甲基化情況的新技術(shù)［1，7］，可以實現(xiàn)此目的。

4.4用于傳染病的高通量檢測

MLPA被報道以來主要用于基因遺傳病的檢測，近些年逐漸發(fā)展到傳染病高通量檢測，表現(xiàn)出了良好的發(fā)展勢頭。Martin等人建立了可以同時檢測15種呼吸道病毒的MLPA方法，敏感性與單個熒光PCR相當(dāng)，但檢測通量大大提高了［8］。Muvunyi等建立了MLPA同步檢測7種性傳播疾病，結(jié)果用單重?zé)晒釶CR驗證，符合性達到100%［9］。Lina等利用MLPA技術(shù)，建立了可以同時檢測10種蜜蜂病毒的高通量篩選技術(shù)，取得了較好效果［10］。國內(nèi)史喜菊等人前期研究建立了五種豬病MLPA同步檢測技術(shù)［2］，在此基礎(chǔ)上，又建立了五種牛病MLPA同步檢測技術(shù)［4］，后期這兩種檢測技術(shù)可以完全融合，實現(xiàn)10種動物疫病的MLPA同步檢測平臺，而且該平臺是開放式的，后期可以隨時加入更多的病原菌。Ehlert 等利用了MLPA技術(shù)建立了同時檢測10種食品過敏原的高通量技術(shù)［11］。

這些研究都表明，MLPA技術(shù)為疫病的多重檢測提供了一種全新的檢測技術(shù)平臺，可用于國內(nèi)動物疫病疫情的檢測、監(jiān)測和普查以及相關(guān)病原疫苗、檢測試劑病原純度的檢測，也可用于動物源性食品相關(guān)病原的檢測。

［1］ Schouten J P，McElgunn C J，Waaijer R，et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification［J］.Nucleic Acids Research，2002，30（12）：1-13.

［2］ 史喜菊，馬貴平，喬彩霞，等. 多重鏈接探針擴增技術(shù)同時檢測五種豬病的研究［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2013，21（6）：745-752.

［3］ 韓瀚，劉敬忠，王清濤. 多重連接探針擴增技術(shù)的研究進展及其應(yīng)用［J］. 診斷學(xué)理論與實踐，2007，6（4）：380-383.

［4］ 史喜菊，馬貴平，柏亞鐸，等. 五種牛病多重鏈接探針擴增同步檢測方法的建立［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2015.

［5］ 張宏，盛劍秋，耿洪剛，等. 多重連接依賴的探針擴增技術(shù)檢測中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌錯配修復(fù)基因大片段缺失［J］. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2006，28（6）：837- 839.［6］ Eldering E，Spek C A，Aberson H L，et al. Expression profiling via novel multiplex assay allows rapid assessment of gene regulation in defined signalling pathways［J］. Nucleic Acids Res，2003，31（23）：e153.

［7］ Nygren A O，Ameziane N，Duarte H M，et al. Methylation specific MLPA （MS-MLPA）：simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences［J］. Nucleic Acids Res，2005，33（14）：e128.

［8］ Reijans M，Dingemans G，Klaassen C H，et al. RespiFinder：a new multiparameter test to differentially identify fifteen respiratory viruses［J］. Journal of Clinical Microbiology，46（4）：1232-1240.

［9］ Muvunyi C M，Dhont N，Verhelst R，et al. Evaluation of a new multiplex polymerase chain reaction assay STDFinder for the simultaneous detection of 7 sexually transmitted disease pathogens［J］. Diagn Microbiol ?nfect Dis，2011 Sep，71（1）：29-37.

［10］ Lina De Smet，Jorgen Ravoet，Joachim R，et al. A versatile MLPA-based diagnostic tool for screening bee viruses［J］. PLoS One，2012，7（10）： e47953. Doi：10.1371/journal. pone.0047953. Epub 2012 Oct 29.

［11］ Ehlert A，Demmel A，Hupfer C，et al. Simultaneous detection of DNA from 10 food allergens by ligation-dependent probe amplification［J］. Food Additive Contamination Part A Chemical Analysis Control Expoort Risk Assessment，2009，26（4）：409-418.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

The Principle and Application of Multiplex Ligation-dependent Probe Amplif cation

Shi Xiju1，Hao Junhu2，Bai Yaduo1，Ma Guiping1，Qiao Caixia1，Liu Quanguo1，Li Yanxin1，Li Bingling1
（1.Beijing Entry-Exit ?nspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026；2.Ningxia Entry-Exit ?nspection and Quarantine Bureau，Yinchuan，Ningxia 750001）

Multiplex ligation-dependent probe amplification（MLPA）is a high throughput detection technology combining nucleic acid hybridization with PCR chain amplification. With it’s high specificity and high sensibility，MLPA could achieved synchronous detection of as many as 50 target molecules. Since 2002，the technology has made a great progress，and been extensively used in gene detection of genetic disease and tumor prognosis，and high-throughput detection of infectious diseases. The principle，advantages and disadvantages，application of MLPA were discussed in this paper.

MLPA；principle；application

S851.3

A

1005-944X（2015）11-0066-04

馬貴平