紫樹莓葉中黃酮提取條件的優(yōu)化

羅建成，李杰，熊鵬

（南陽理工學院生化學院，河南南陽473004）

紫樹莓葉中黃酮提取條件的優(yōu)化

羅建成，李杰，熊鵬

（南陽理工學院生化學院，河南南陽473004）

采用響應面分析優(yōu)化有機溶劑提取樹莓葉中總黃酮的工藝。在用有機溶劑提取工藝中，紫樹莓葉黃酮提取工藝最佳工藝條件：采用乙醇為溶劑、乙醇濃度為57.8%、提取溫度62.1℃、提取時間92.7 min、料液比1∶50（g/mL）。對實驗優(yōu)化條件進行驗證得到提取率為12.56%。

紫樹莓葉；黃酮；條件優(yōu)化；響應面分析法

樹莓屬薔薇科薔薇亞科懸鉤子屬中的一種落葉灌木的成熟果實，又名托盤、馬林、覆盆子等［1］，樹莓的藥用價值有詳細記載。樹莓全株入藥，有補肝腎、縮小便、助陽、固精之功效。民間用于治療腹瀉、目赤、酒精中毒等［2］。在樹莓葉片中起主要作用的是黃酮類物質。據相關文獻報道，樹莓葉中黃酮含量要遠高于樹莓果和籽。徐雅琴等的研究證實［3］：樹莓葉中含有豐富的黃酮類物質，黃酮類化合物是植物界分布較廣的一大類多酚類物質，常以游離或糖苷形式存在于植物體內，是一類具有顯著生理藥理活性和開發(fā)前景的植物成分，其中山奈酚（kaempferol）和槲皮素（quercetin）［4-5］具有明顯的抗癌、抗氧化，抗心肌肥厚功能，并能促進骨髓中成骨細胞的形成。樹莓葉提取物粗黃酮具有一定的抗氧化作用［3］。樹莓葉提取物粗黃酮對DPPH·有較好的清除作用，且隨劑量的增加清除作用增強。

由于樹莓葉黃酮類化合物多具有游離的酚羥基，一般情況易溶于堿性溶液和極性較大的有機溶劑，大多數以黃酮苷的形式存在，其易溶于水、含水乙醇、甲醇等極性溶劑，少數以黃酮苷元的形式存在。黃酮類化合物性質之間差別較大，每種樹莓葉中所含的雜質又不完全相同，因此尚無一個通用的提取方法。目前的提取方法主要有以下幾種：有機溶劑提取、堿性稀醇或堿性水提取、超聲提取、微波提取、超臨界萃取、酶解提取、超濾法等方法［6-13］，再對粗提物進行精制、純化處理。利用響應面分析法優(yōu)化有機溶劑提取樹莓葉中的黃酮提取工藝鮮報道。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

紫樹莓葉：河南南陽市產。

1.1.2儀器

HHS-6電熱恒溫水浴鍋：上海躍進醫(yī)療器械廠；BS110S電子天平：德國（北京）賽多利斯天平有限公司；TDL-40B臺式離心：上海申光儀器儀表有限公司；FW-100高速萬能粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；101A-2電熱鼓風干燥箱機：上海申光儀器儀表有限公司；721 N分光光度計：上海精密儀器有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器游戲公司。

1.1.3試劑

蘆丁標準品，甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、硝酸鋁、乙酸乙酯和氫氧化鈉均為分析純且均為天津金匯太亞化學試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1紫樹莓葉黃酮的提取

黃酮成分粗提時的工藝流程：清洗→干燥→黃酮粗提物

1.2.2蘆丁標準曲線的繪制

準確稱取經105℃烘干至恒重的蘆丁標準品15 mg，用80%乙醇溶解定容100 mL容量瓶，得到0.15 mg/mL的蘆丁標準液，精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的蘆丁標準液分別于7個潔凈的25 mL容量瓶中，分別加入6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL的80%乙醇溶液，然后向每個容量瓶中各加入5% NaNO2溶液1.0 mL充分振蕩后靜置6 min，再向每個容量瓶中加入10%Al（NO3）3［14］溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置6 min，向每個容量瓶中各加入10%NaOH溶液10.0 mL，然后用80%乙醇定容至25 mL容量瓶刻度處，充分振蕩后靜置15 min，在507 nm處測吸光度。

1.2.3樣品測定及提取率的計算

1.2.3.1樣品測定方法

提取液離心以后在50 mL的容量瓶定容。精密吸取10 mL溶液，在20 mL的刻度試管中定容。從刻度試管中精密吸取稀釋后的溶液6mL，放入另一備用20mL的刻度試管；然后向每個刻度試管中各加入5%NaNO2溶液1.0 mL充分振蕩后靜置6 min，再向每個刻度試管中加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置6 min，向每個刻度試管中各加入10%NaOH溶液10.0 mL，然后用80%乙醇定容至20 mL，充分振蕩后靜置15 min，在507 nm處測吸光度。

1.2.3.2黃酮提取率的計算

利用標準曲線方程計算出提取物的重量，其公式可整理成：

x=（0.8y-0.007 8）/0.339 5

式中：y為測得的吸光度值；x為由標準曲線方程計算出提取物的重量。

提取率=提取物的重量/紫樹莓葉的重量×100%

由于本次試驗黃酮含量一般，所以在測量時提取液稀釋20倍，則黃酮提取率的計算公式為：η%=x× 20×50×100/6×1 000

1.3不同因素對紫樹霉葉中黃酮類化合物提取工藝的影響

1.3.1不同提取溶劑對黃酮提取率的影響

分別準確稱取1.0 g紫樹莓葉粉末，在料液比為1∶50（g/mL），分別采用不同的提取溶劑，甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯；60℃的水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.2不同溶劑濃度對黃酮提取率的影響

分別準確稱取1.0 g紫樹莓葉粉末，在乙醇作為提取溶劑，乙醇濃度分別為：40%、50%、60%、70%、80%、95%。料液比為1∶50（g/mL），60℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.3不同提取溫度對黃酮提取率的影響

分別準確稱取1.0 g紫樹莓葉粉末，在60%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50（g/mL），振蕩速度120 r/min，在不同溫度下提取2 h，提取溫度分別為：40、50、60、70、80℃。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.4提取時間對黃酮提取率的影響

分別準確稱取1.0 g紫樹莓葉粉末，在60%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50（g/mL），70℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取，提取時間分別為：60、90、120、150、180 min。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.5提取溶劑的料液比對黃酮提取率的影響

分別準確稱取1.0 g紫樹莓葉粉末，在60%乙醇作為提取溶劑，60℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.6響應面分析

據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理［15］，綜合單因素試驗所得結果，3個對黃酮提取率影響顯著的因素，分別以A、B和C為代表，每一個自變量的試驗水平分別以－1、0、1進行編碼0代表最高水平、-1為最高水平左面的水平、1為最高水平右面水平。以紫樹莓葉黃酮提取率為響應值（Y），在單因素試驗基礎上，采用三因素三水平的響應面分析方法，試驗因素與水平設計。對得出的結果進行驗證。

2結果與分析

2.1蘆丁標準曲線的繪制

根據數據得到蘆丁含量和吸光度值之間標準曲線如圖1。

圖1　蘆丁標準品標準溶液在507 nm處標準曲線Fig.1Rutin standard standard solution at 507 nm standard curve

通過一元線性回歸方程為：y=0.339 5x+0.007 8。式中：y為507 nm處的吸光度值；x為黃酮的含量，mg；經過計算，相關系數為：R2=0.997 5，回歸極顯著。所以在蘆丁含量為0～0.9 mg的范圍內，是可以用該方法檢測黃酮含量的。

2.2最佳溶劑選擇

分別準確稱取1.0 g紫樹莓葉粉末，在料液比為1∶50（g/mL），分別采用不同的提取溶劑，甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯；60℃的水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶，稀釋20倍后按1.2.3.1給出的方法測量。實驗結果數據如表1。

表1　不同溶劑的黃酮提取率Table 1Different solvents of flavonoids extraction yield

由表1可知使用不同溶劑，樹莓葉中黃酮的提取率不同，由上表可知乙醇的提取率最大。

2.3最佳濃度選擇

分別準確稱取1.0 g紫樹莓葉粉末，在乙醇作為提取溶劑，乙醇濃度分別為：40%、50%、60%、70%、80%、95%。料液比為1∶50（g/mL），60℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶，稀釋20倍后按1.2.3.1給出的方法測量。實驗結果數據如表2。

由表2可知隨著乙醇濃度的增加，提取率由大變小，在60%乙醇濃度下提取率達到最大。

表2　不同濃度的黃酮提取率Table 2Different concentrations of flavonoids extraction yield

2.4最佳溫度選擇實驗結果

分別準確稱取1.0 g紫樹霉葉粉末，在60%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50（g/mL），振蕩速度120r/min，在不同溫度下提取2 h，提取溫度分別為：40、50、60、70、80℃。提取液離心，取上清液定容至50ml容量瓶，稀釋20倍后按1.2.3.1給出的方法測量。實驗結果數據如表3。

表3　不同溫度的黃酮提取率Table 3The flavonoids extraction rate of different temperature

由表3知在開始隨溫度越大提取率越高，之后反而下降，分析有可能高溫使黃酮受到了破壞。因此實驗選取60℃為合適溫度條件。

2.5最佳時間選擇

分別準確稱取1.0 g紫樹莓葉粉末，在60%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50（g/mL），70℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取，提取時間分別為：10、20、30、40、50 min。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶，稀釋20倍后按1.2.3.1給的方法測量。實驗結果數據如表4。

表4　不同提取時間的黃酮提取率Table 4Different extracting flavonoids extraction yield of time

由表4知最開始提取時間長提取率越高，但在120 min之后反而越小，分析有可能是樹莓葉中黃酮比較容易提取，時間越長提取出來的其他物質較多，和黃酮結合成了其他物質，還有就是黃酮被氧化，因此實驗選取提取時間為120 min。

2.6最佳料液比選擇實驗結果

分別準確稱取1.0 g紫樹莓葉粉末，在60%乙醇作為提取溶劑，60℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h，料液比分別為：1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）。提取液離心，取上清液定容至50ml容量瓶，稀釋20倍后按1.2.3.1給出的方法測量。實驗結果數據如表5。

表5　不同料液比的黃酮提取率Table 5Different material liquid ratio of flavonoids extraction yield

由表5知料液比與提取率關系為料液比越大越好，但是在1∶50之后提取率增長不明顯，考慮成本因素實驗選取1∶50（g/mL）作為實驗的料液比。

2.7響應面分析

據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗所得結果，確定料液比為1∶50（g/mL），選取乙醇濃度、提取時間、提取溫度3個對黃酮提取率影響顯著的因素，以紫樹莓葉黃酮提取率為響應值（Y），在單因素試驗基礎上，采用三因素三水平的響應面分析方法，試驗因素與水平設計見表6。

表6　響應面分析因素與水平Table 6The response surface analysis of factors and levels

對乙醇濃度A、提取時間B和提取溫度C作變換如下：A=（Z-60）/10，B=（t－90）/30，C=（T－60）/10（Z、t、T分別為試驗乙醇濃度、提取時間及提取溫度）以A、B、C為自變量，以3次試驗所得多糖提取率的平均值為響應值（Y），結果見表7，其中1～12是析因試驗，13～15是中心試驗，用來估計試驗誤差。

表7　響應面分析方案及結果Table 7The response surface analysis methods and results

由表7的Box-Behnken試驗設計及結果，用SAS統(tǒng)計分析軟件進行二次多項回歸擬合，可建立二次響應面的回歸分析模型，提取率的估計回歸系數如表8，整理后的二次回歸方程如下：Y=11.880 3-0.451 5A-0.1422 5B+0.181 5C+0.167A×B-0.324A×C-0.294 5B× C-0.800 667A2-0.555 167B2-0.692 167C2，R值為0.964 8＞0.9方法可靠。

表8　提取率的估計回歸系數Table 8Extraction yield estimates of regression coefficient

表9　提取率的方差分析Table 9The extraction yield of analysis of variance

由回歸方程的方差分析表8、9可知，模型一次項A顯著，二次項A2極顯著，B2、C2顯著，交互項都不顯著。說明3個因素之間的交互作用對試驗結果的影響不顯著?；貧w方程的F值為19.84，大于F值的概率（Pr＞F）為0.048，顯示該方程的回歸顯著。

由圖2至圖4可知，提取溶劑濃度、提取時間和溫度對樹莓葉中的黃酮提取的效應，有一個極值點，兩個不同因素間的交互作用黃銅的提取影響不是簡單的線性關系。所建立的模型在進行的試驗范圍之內有一穩(wěn)定點，穩(wěn)定點即是極大值所在的點。

為求出基礎黃酮提取的優(yōu)化條件和優(yōu)化條件所對應的黃酮提取率的最大理論值，對所建立的回歸方程中的變量A、B、C分別求其一階偏導，并令其等于零，可得三元一次方程組，對此方程組進行求解，可得A=－0.214 345 66，B=0.091 685 11，C=0.206 138 93，代入前述的變換公式得到乙醇濃度57.8%、提取時間為92.7 min、提取溫度62.1℃。計算理論優(yōu)化提取率為12.48%，按照上述條件即紫樹莓葉黃酮提取工藝最佳工藝條件為采用乙醇為溶劑、乙醇濃度為57.8%、提取溫度62.1℃、提取時間92.7 min、料液比1∶50（g/mL）實驗條件進行驗證得到提取率為12.56%，實測平均值與預測值擬合較好，因此，模型能很好地預測真實的提取情況。

圖2　乙醇濃度（A）與提取時間（B）的響應面圖Fig.2Extraction yield and ethanol concentration，extraction of the surface figure of the time

圖3　乙醇濃度（A）與提取溫度（C）的響應面圖Fig.3Extraction yield and ethanol concentration，extraction temperature of the surface figure

圖4　提取時間（B）與提取溫度（C）的響應面圖Fig.4Extraction yield and extraction time，extraction temperature of the surface figure

3結論

在用有機溶劑提取工藝中，紫樹莓葉黃酮提取工藝最佳工藝條件為采用乙醇為溶劑、乙醇濃度為57.8%、提取溫度62.1℃、提取時間92.7 min、料液比1∶50（g/mL）。對實驗優(yōu)化條件進行驗證得到提取率為12.56%。

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Optimization of Extraction Conditions of Purple Raspberry Leaf Flavonoids

LUO Jian-cheng，LI Jie，XIONG Peng

（College of Biological and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，Henan，China）

Organic solvent extraction of raspberry was optimized by using response surface analysis technology of total flavonoids in the leaves.In organic solvent extraction process，purple raspberry leaf flavonoids extraction process optimum technological conditions for using ethanol as solvent，57.8%ethanol concentration，extraction temperature 62.1℃，the extracting time 92.7 min，material liquid than 1∶50（g/mL）.The experimental optimization conditions were verified，the extraction yield could reach 12.56%under these conditions.

purple raspberry leaf；flavonoid；conditions optimization；response surface analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.010

2015-02-06

羅建成（1965—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：生物技術。