肺動(dòng)脈高壓防治機(jī)制探討

河南省商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 (商丘 476000)　張　濤　王恩漫　王群讓

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肺動(dòng)脈高壓防治機(jī)制探討

河南省商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 (商丘 476000)張濤王恩漫王群讓△

常鳳軍▲

目的：研究大鼠肺高壓(PH)模型體內(nèi)循環(huán)微粒(MPs)的改變及左旋精氨酸(L-Arg)對MPs的影響，探討肺動(dòng)脈高壓的防治機(jī)制。方法：取18只SD雄性大鼠隨機(jī)分為三組(n=6)：對照組(C組)、MCT組(M組)L-Arg/MCT組(L組)。C組不做處理，通過腹腔注射野百合堿誘導(dǎo)M組和L組大鼠PH模型，隨后L組大鼠每日注射L-Arg，C組和M組每日注射等量的生理鹽水共3周。3周時(shí)測大鼠右心室壓力、取血提取MPs、檢測MPs含量及MPs對大鼠肺血管舒張功能的影響。結(jié)果：M組和L組的MPs含量較C組均升高(P<0.05)，且L組MPs含量較M組低(P<0.05)；M組和L組MPs對血管舒張功能的影響無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論：L-Arg通過減少肺高壓大鼠體內(nèi)的MPs的含量而不是MPs的質(zhì)量來改善肺高壓，進(jìn)一步闡明了L-Arg 防治PH的分子機(jī)制。

肺高壓(Pulmonary hypertension, PH)嚴(yán)重危害了人民的健康，而且目前治療肺高壓的藥物價(jià)格不菲，這給患者帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。以往我們[1]及其他學(xué)者[2,3]的研究發(fā)現(xiàn)：左旋精氨酸(L-Arg)可以改善內(nèi)皮功能進(jìn)而緩解PH；循環(huán)微粒(MPs)通過以下途徑加重PH：降低肺血管內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)和增加彈性蛋白表達(dá)；損害肺血管舒張功能。鑒于L-Arg與MPs對PH影響的交叉，我們將研究L-Arg 是否可以影響MPs對肺血管舒張功能的影響而緩解PH，以便進(jìn)一步了解L-Arg防治PH的分子機(jī)制。

材料與方法

1 動(dòng)物與試劑 18只雄性SD大鼠，體重約200±10g，均購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。野百合堿 (Monocrotaline, MCT, sigma- aldrich，USA)，L-Arg (Sigma- Aldrich，USA)，K-H液試劑均為國產(chǎn)分析純，均購自國奧生物科技有限公司；戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich, USA)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibico, USA)；BCA試劑盒(Thermo Scientific，USA)；重酒石酸去甲腎上腺素(Noradrenaline, Bitartrate, NA)，氯化乙酰膽堿(Acetylcholine chloride, Ach)，N -硝基-L-精氨酸甲酯(N- nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)購自Sigma-Aldrich。

2實(shí)驗(yàn)儀器 MD 2 000生物信號(hào)采集系統(tǒng)購買自南京醫(yī)科大學(xué)，BI -420E+生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司，EDTA抗凝管、注射器購自BD，高速離心機(jī)購自Beckman coulter。

3建模及分組 PH模型按文獻(xiàn)制備[4]：生理鹽水和乙醇(2∶8)混合液溶解MCT為20 g/L的溶液，將L-Arg用生理鹽水配成150 g/L的溶液。18只大鼠隨機(jī)分為三組(n=6)：對照組(C組)、MCT組(M組)、 L-Arg/ MCT組(L組)。C組不做處理，M組和L組大鼠腹腔注射MCT 50 mg/kg誘導(dǎo)PH，之后L組每日腹腔注射L-Arg(500mg/kg)，C組和M組每日注射等量的生理鹽水共3周。

4檢測方法

4.1 肺動(dòng)脈壓力測定: 3周結(jié)束時(shí)，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，BL-420E 生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)檢測右心室收縮壓(Right ventricular systolic pressure，RVSP)[3]以間接反應(yīng)肺動(dòng)脈壓力。

4.2 測定MPs： 肺動(dòng)脈壓力測定結(jié)束后采腹主動(dòng)脈血，參照文獻(xiàn)提取MPs[5]：首先離心(4℃ 11000g 2min)得到缺乏血小板血漿，然后取2ml缺乏血小板血漿再次離心(4℃ 13000g 45min)，棄去上清，用100ul RPMI 1640培養(yǎng)基重懸沉于管底的MPs。BCA試劑盒測定MPs蛋白濃度。

4.3 舒張功能：開胸取大鼠肺動(dòng)脈，小心去除動(dòng)脈周圍組織，將動(dòng)脈剪為3～4 mm的血管段并移入預(yù)先通氣、(37±0.5)℃的K-H液(KH2PO41.2 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、CaCl22.5 m mol/L、glucose 11.0 mmol/L 、NaCl 118.0 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、NaHCO325.0 mmol/L)的浴皿中，調(diào)節(jié)MD 2 000生物信號(hào)采集系統(tǒng)。恒溫通氣，維持2g前負(fù)荷并讓血管環(huán)平衡1h，期間每15 min換1次K-H液。平衡結(jié)束后，加KEL(終濃度10-6mol/L)收縮3次，檢測血管環(huán)穩(wěn)定性。然后后進(jìn)行以下檢測：用MPs(1 mg/ml)刺激血管環(huán)30min后用NA(終濃度10-6mol/L)收縮血管環(huán)(Vmax)，然后用Ach(終濃度10-7～10-4mol/L)舒張血管并記錄相應(yīng)張力值(Vach)，計(jì)算舒張率：(Vmax-Vach)/ Vmax。洗脫藥物后用L-NAME (100μmol/L)孵育血管環(huán)30 min，重復(fù)用NA和ACh處理血管環(huán)以檢測內(nèi)皮依賴的血管舒張功能的變化。

結(jié)　果

1 三組大鼠RVSP比較M組為25.42±2.37 mmHg，較對照組(10.33±2.15 mmHg)明顯升高(P<0.05)，提示PH建模成功；L組的17.89±2.37 mmHg，較M組低有所減低，說明L-Arg可以緩解PH病情。

2三組大鼠MPs檢測結(jié)果比較見附表。 M組大鼠體內(nèi)MPs含量較對照組明顯升高(P<0.05)，L-Arg減少一部分MPs的產(chǎn)生(L組)。

3三組大鼠血管舒張功能檢測結(jié)果比較見圖1～2。對照組血管舒張率為(90.7±3.43)%，M組為(40.63±8.32)%，提示MPs明顯抑制了肺血管的舒張功能。L-Arg(L組)組血管舒張率為(43.24±6.52)%，提示L-Arg并沒有緩解MPs對大鼠肺血管舒張功能的損害。

圖1　乙酰膽堿對血管舒張率的影響

圖2 MPs對大鼠肺血管舒張功能的影響( *與對照組比較，P<0.05)

附表　 三組大鼠

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05

討　論

PH的病理機(jī)制復(fù)雜，多種內(nèi)因子參與了PH的發(fā)生和發(fā)展，PH的肺血管阻力進(jìn)行性增加，肺血管發(fā)生增殖及重塑[6]。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是主要的血管內(nèi)皮舒張因子。L-Arg作為內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的底物可以促進(jìn)血管舒張，維持肺動(dòng)脈壓力保持在正常水平。以往的研究顯示[1]：L-Arg可以上調(diào)eNOS蛋白的表達(dá)、抑制血小板的聚集、減少內(nèi)皮素-1的產(chǎn)生、促進(jìn)血管舒張而緩解PH。

MPs是在內(nèi)皮細(xì)胞激活、發(fā)生凋亡時(shí)向周圍的環(huán)境中分泌的大小約0.1～1 Lm，是亞微米級的細(xì)胞顆粒[7]。Hugel B 和Wang JM研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)MPs含量反映內(nèi)皮損傷和功能障礙[4,7]。我們曾發(fā)現(xiàn)[3]：MPs可以減少二尖瓣內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS蛋白的表達(dá)并減少NO的產(chǎn)生。王旭蘭也發(fā)現(xiàn)[2]: MPs通過抑制肺血管中eNOS蛋白表達(dá)和上調(diào)彈性蛋白而加重肺高壓病情。鑒于MPs與L-Arg在肺高壓作用上有很多交叉之處，我們這次研究的假設(shè)就是：L-Arg是否是直接或間接通過作用于MPs而實(shí)現(xiàn)緩解肺高壓的。

本研究發(fā)現(xiàn)：L-Arg部分減少了PH大鼠體內(nèi)增高的MPs，但是并沒有改善MPs對體外肺血管舒張功能的抑制作用。即：L-Arg通過為肺血管內(nèi)皮細(xì)胞提供NO底物改善肺動(dòng)脈壓力，進(jìn)而減少M(fèi)Ps的含量和緩解MPs對肺高壓的加重，但是L-Arg并沒有改變MPs的質(zhì)量(L-Arg沒有緩解M組大鼠體內(nèi)MPs對離體肺血管舒張功能的抑制：L-Arg→PH↓→MPs含量↓(質(zhì)量不變)→PH↓的循環(huán))。我們的研究進(jìn)一步闡明了L-Arg防治PH的機(jī)制，為今后尋求更好的防治PH的藥物提供理論依據(jù)。

[1] 常鳳軍，魏偉，歐志君，等. 左旋精氨酸恢復(fù)eNOS和iNOS平衡并制肺動(dòng)脈高壓的研究[J].中華胸心血管外科雜志,2012，28(4):237-240.

[2] 王旭蘭. 循環(huán)微粒對大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮的損害及與肺動(dòng)脈高壓的關(guān)系[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2015,44(1):12-14.[3] Ci HB, Ou ZJ, Chang FJ,etal. Endothelial microparticles increase in mitral valve disease and impair mitral valve endothelial function[J]. American Journal of Physiology- Endocrinology and Metabolism,2013,304(7): 695- 702.

[4] Hugel B, Carmen M, Martinez MC,etal. Membrane microparticles: two sides of the coin[J].Physiology,2005,20(1): 22-27.

[5] 王妍,陶軍,涂 昌,等. 高血壓病對內(nèi)皮微顆粒水平的影響[J].中華老年心腦血管病雜志, 2006, 8(4): 222- 224.

[6] Grimminger F, Schermuly RT. PDGF receptor and its antagonists: role in treatment of PAH[J].Adv Exp Med Biol,2010,661(6):435-46.

[7] Boulanger CM, Amabile N, Guerin AP,etal. In vivo shear stress determines circulating levels of endothelial microparticles in end-stage renal disease[J].Hypertension,2007,49(4): 902-908.

(收稿：2015-03-20)

陜西省人民醫(yī)院心臟外科

R544.1

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.005

△陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科

主題詞 高血壓，肺性/藥物療法精氨酸/治療應(yīng)用模型，動(dòng)物大鼠