中間型單核細(xì)胞及TREM-1在點(diǎn)滴狀銀屑病中的表達(dá)

錢 青白彥萍曹永彤高春巖申宇鴻

中間型單核細(xì)胞及TREM-1在點(diǎn)滴狀銀屑病中的表達(dá)

錢 青1白彥萍2曹永彤2高春巖1申宇鴻1

目的： 檢測點(diǎn)滴狀銀屑病患者中間型單核細(xì)胞比例及其細(xì)胞表面觸發(fā)受體（TREM-1）的表達(dá)，探討其在點(diǎn)滴狀銀屑病疾病過程中的作用。方法： 采集28例點(diǎn)滴狀銀屑病患者和24例健康對照者外周血，流式細(xì)胞術(shù)檢測中間型單核細(xì)胞及TREM-1+中間型單核細(xì)胞比。ELISA檢測血清游離TREM-1（sTREM-1）濃度。計(jì)算中間型單核細(xì)胞與PASI評分及抗鏈球菌溶血素O（ASO）的相關(guān)性。結(jié)果： 點(diǎn)滴狀銀屑病患者中間型單核細(xì)胞比例及sTREM-1水平分別為13.5±4.8%和277.8 pg/mL，顯著高于健康對照組的3.4±1.1%和162.6 pg/mL，（P＜0.05）；患者組TREM-1平均熒光強(qiáng)度及陽性中間型核細(xì)胞頻率分別為24.8±7.2和80.4±6.8%，低于健康對照組的35.3±5.1和95.6±5.7%，（P＜0.05）?；颊咧虚g型單核細(xì)胞比例與PASI，ASO水平正相關(guān)。結(jié)論： 中間型單核細(xì)胞及其表面TREM-1受體可能參與點(diǎn)滴狀銀屑病的疾病過程。

髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1； 中間型單核細(xì)胞； 點(diǎn)滴狀銀屑病

點(diǎn)滴狀銀屑病除了自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化和表皮角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖，固有免疫系統(tǒng)因細(xì)菌、真菌等微生物感染引起過度活化在疾病過程中也發(fā)揮重要作用。1在炎癥反應(yīng)過程中，中間型單核細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原提呈和加工能力，具有較高的活化炎癥反應(yīng)的潛能；2單核細(xì)胞表面髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1（TREM-1）具有激發(fā)和放大炎癥反應(yīng)的作用。3本次研究通過檢測點(diǎn)滴狀銀屑病患者外周血中間型單核細(xì)胞比例及其TREM-1表達(dá)，并分析其與點(diǎn)滴狀銀屑病其他診斷指標(biāo)或致病物質(zhì)（如：抗鏈球菌溶血素O）的相關(guān)性，闡明中間型單核細(xì)胞在點(diǎn)滴狀銀屑病疾病過程中的作用。

1　材料與方法

1.1研究對象 選取點(diǎn)滴狀銀屑病患者28例，其中男12例、女16例，年齡（23.5±12.1）歲，同時設(shè)健康對照24例，其中男11例、女13例，年齡（24.5±14.2）歲，無自身免疫性疾病或近期感染史。兩組間性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，征得患者知情同意，采集外周血3 mL。

1.2主要儀器與試劑 異硫氰酸熒光素（FITC）鼠抗人-CD14、葉綠素蛋白偶聯(lián)物（PerCP-cy5.5）鼠抗人-CD16單克隆抗體及同型對照購自BD公司，PE-鼠抗人TREM-1及同型對照購自R&D公司；流式細(xì)胞儀FACSCanto為 BD公司產(chǎn)品。抗菌肽 LL-37及sTREM-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒分別購自Hycult Biotech公司和R&D公司。

1.3方法

1.3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面受體 每100μL外周血加入10μL PerCP-cy5.5-抗人CD16、FITC-抗人CD14和PE-抗人TREM-1及同型對照，室溫避光孵育30 min，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞后，用1mL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌兩次，1500 rpm離心6 min，棄上清，加入400μL PBS重懸細(xì)胞。FACSCanto采用前向散射光（FS）和側(cè)向散射光（SS）區(qū)別單核細(xì)胞（圖1aR1），以中間型單核細(xì)胞設(shè)門（圖1b R4），測定中間型單核細(xì)胞/單核細(xì)胞百分率，以及TREM-1+中間型單核細(xì)胞/中間型單核細(xì)胞百分率。

1.3.2銀屑病相關(guān)診斷或評估指標(biāo) 計(jì)算所有患者銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）。外周血經(jīng)500×g離心5 min，分離血漿，儲存在-80℃低溫冰箱。按ELISA檢測法檢測sTREM-1，每標(biāo)本測2次，取均值?？规溓蚓苎豋（ASO）采用免疫比濁法，BNProSPec特定蛋白分析儀及配套試劑檢測。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用Stata 7.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，本次研究全部為計(jì)量資料，正態(tài)性分布用ˉx±s表示，兩組比較采用students't-test檢驗(yàn)；偏態(tài)資料用中位數(shù)（M）表示，兩組比較采用Mann-Whitney U test，作雙側(cè)檢驗(yàn)。線性相關(guān)系數(shù)計(jì)算采用Pearson相關(guān)系數(shù)。取P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測中間型單核細(xì)胞比例 點(diǎn)滴狀銀屑病患者中間型單核細(xì)胞比例（3.5±4.8%）高于健康對照組（3.4±1.1%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1d）。

圖1　a：流式細(xì)胞儀采用FS和SS區(qū)別單核細(xì)胞（R1）；b：健康對照者中間型單核細(xì)胞（R4）；c：點(diǎn)滴狀銀屑病患者中間型單核細(xì)胞（R4）；d：兩組中間型單核細(xì)胞比例比較

2.2中間型單核細(xì)胞TREM-1表達(dá) 流式細(xì)胞儀以中間型單核細(xì)胞設(shè)門，測定TREM-1+中間型單核細(xì)胞/中間型單核細(xì)胞百分率（圖2a）和TREM-1 MFI平均熒光強(qiáng)度（圖2b）。

圖2　a：患者中間型單核細(xì)胞TREM-1表達(dá)；b：對照組中間型單核細(xì)胞TREM-1表達(dá)

點(diǎn)滴狀銀屑病患者中間型單核細(xì)胞TREM-1陽性比例及平均熒光強(qiáng)度（MFI）均低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1　中間型單核細(xì)胞TREM-1表達(dá)

2.3ELISA檢測血清sTREM-1濃度 點(diǎn)滴狀銀屑病患者血清sTREM-1濃度為152.5～372.4 pg/mL，平均為277.8 pg/mL，對照組濃度為124.3～209.7 pg/ m L，平均為162.6 pg/m L。經(jīng)Mann-Whitney U test檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4患者中間型單核細(xì)胞比例與臨床數(shù)據(jù)相關(guān)性分析 點(diǎn)滴狀銀屑病患者中間型單核細(xì)胞比例與血清sTREM-1濃度、ASO、PASI呈正相關(guān)（圖3）。

圖3　a：中間型單核細(xì)胞與sTREM-1相關(guān)性分析；b：中間型單核細(xì)胞與ASO相關(guān)性分析；c：中間型單核細(xì)胞與PASI相關(guān)性分析

3　討論

單核細(xì)胞根據(jù)其表面標(biāo)記CD14、CD16分為3個亞群：經(jīng)典型（CD14highCD16-）、中間型（CD14highCD16+）和非經(jīng)典型（CD14lowCD16++），分別約占外周血單核細(xì)胞的85%、5%和10%，不同的亞群在表型、功能及炎癥活化潛能方面存在明顯差異。5經(jīng)典型具有很強(qiáng)的吞噬功能；非經(jīng)典型高表達(dá)細(xì)胞骨架能動性相關(guān)基因，能識別炎癥信號并迅速遷移到炎癥部位，浸潤組織后分化為巨噬細(xì)胞。中間型單核細(xì)胞高表達(dá)編碼MHC-II類分子相關(guān)基因（如HLA-DR和CD74），具有較強(qiáng)的抗原提呈和加工能力，并在T細(xì)胞活化、增殖及抗原提呈過程中起重要作用。此外，還表達(dá)促血管生成的相關(guān)分子，具有促血管生成的特性。4本次研究發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)滴狀銀屑病患者外周血中間型單核細(xì)胞比例明顯升高。Fujisawa等6研究證實(shí)，泛發(fā)性膿皰型銀屑病患者外周血中間型單核細(xì)胞比例明顯升高。

TREM-1表達(dá)于中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面，具有激發(fā)和放大炎癥反應(yīng)的作用，在炎癥反應(yīng)過程中，通過基質(zhì)金屬蛋白酶的水解，膜表面TREM-1從細(xì)胞表面脫落下來，形成sTREM-l，從而下調(diào)炎癥反應(yīng)，是機(jī)體在炎癥反應(yīng)中的一種自身保護(hù)調(diào)節(jié)。7血漿sTREM-1濃度可用于臨床膿毒癥的早期診斷以及評估病情嚴(yán)重程度。8在急性胰腺炎、炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，血清sTREM-1濃度均不同程度升高。9中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面TREM-1表達(dá)在炎癥反應(yīng)中升高或降低與感染的類型、疾病的炎癥嚴(yán)重程度及病程有關(guān)。10，11本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)滴狀銀屑病患者血清sTREM-1升高，中間型單核細(xì)胞TREM-1表達(dá)明顯下降，說明中間型單核細(xì)胞TREM-1參與炎癥反應(yīng)。

ASO是診斷鏈球菌感染的敏感指標(biāo)。較多研究表明，12點(diǎn)滴狀銀屑病與細(xì)菌感染有關(guān)，最常見的細(xì)菌包括葡萄球菌和鏈球菌等，機(jī)體其他部位的感染，如扁桃體、腸道、牙周炎也會誘發(fā)銀屑病。中間型單核細(xì)胞在感染性疾病和多種自身免疫性疾病過程中發(fā)揮重要作用，包括敗血癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、多發(fā)性硬化癥、1型糖尿病等。13，14本次研究證實(shí)，點(diǎn)滴狀銀屑病患者外周血中間型單核細(xì)胞比例與ASO濃度正相關(guān)。

本次研究還發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)滴狀銀屑病患者外周血中間型單核細(xì)胞比例與PASI評分正相關(guān)，F(xiàn)ujisawa等6用吸附法去除中間型單核細(xì)胞可明顯改善患者臨床癥狀。在銀屑病鼠模型中用白細(xì)胞毒素（LtxA）促進(jìn)中間型單核細(xì)胞凋亡具有顯著的治療作用。15因此，通過調(diào)控單核細(xì)胞凋亡或向非炎性單核細(xì)胞極化可能是治療點(diǎn)滴狀銀屑病的新策略。有研究表明，TREM-1活化可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向促炎型（M1）極化，16用TREM -1活化性抗體活化單核細(xì)胞TREM-1，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為不成熟DC（iDC），導(dǎo)致T細(xì)胞增殖。17但TREM-1在單核細(xì)胞向中間型極化過程中的作用有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，點(diǎn)滴狀銀屑病患者外周血中間型單核細(xì)胞比例升高，并與PASI具有相關(guān)性，其在銀屑病病情和療效評估中的作用需進(jìn)一步采用大樣本驗(yàn)證。單核細(xì)胞TREM-1參與點(diǎn)滴狀銀屑病發(fā)病過程，導(dǎo)致TREM-1活化的機(jī)制也需進(jìn)一步研究。調(diào)控外周血單核細(xì)胞極化及其TREM-1表達(dá)可能是治療點(diǎn)滴狀銀屑病的新途徑。

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（收稿：2015-03-02 修回：2015-05-15）

·臨床研究·

Expression of TREM-1 and intermediatemonocytes in patientsw ith psoriasis guttata

QIAN Qing，BAI Yan-ping，CAO Yong-tong，et al.Department of Dermatology，Peking Hepingli Hospital，Beijing，P.R.China，100013

Objective：To detect the levelof TREM-1 and intermediatemonocytes in the patientswith psoriasis guttata，in order to determine TREM-1's role in the pathogenesis process of psoriasis guttata.M ethods：The peripheral blood was collected from 28 patients and 24 healthy controls.The percentage of intermediate monocytes and TREM-1 expression were analyzed through flow cytometry.The level of sTREM-1 in serum was detected by ELISA.The correlation between intermediatemonocytes，the levels of PASIand ASOwere assessed.Results：The percentage of intermediatemonocytes and the level of sTREM-1 in patientswere 13.5± 4.8%and 277.8 pg/mL，which was higher than those of healthy controls（3.4±1.1%，162.6 pg/mL），with significantly differences（P＜0.05）.The positivity rate of TREM-1 in intermediatemonocytes（80.4±6.8%）and the fluorescence intensity of TREM-1（24.8±7.2）were lower than those of healthy controls（95.6±5.7% and 35.3±5.1）（P＜0.05）.There was positive correlation between the percentage of intermediate monocytes and the levels of PASIand ASO（P＜0.05）.Conclusion：TREM-1 and intermediate monocytesmay be involved in the progress of the disease.

triggering receptor expressed on myeloid cells-1；intermediatemonocytes；psoriasis guttata

北京市東城區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2014-4-005）

1北京市和平里醫(yī)院，北京，100013

2北京市中日友好醫(yī)院，北京，100029