5 種食用菌多糖理化性質(zhì)及免疫活性的比較研究

劉　蘇，姜　玥，羅建平*，潘利華，查學(xué)強(qiáng)

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

5 種食用菌多糖理化性質(zhì)及免疫活性的比較研究

劉蘇，姜玥，羅建平*，潘利華，查學(xué)強(qiáng)

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

目的：研究平菇、茶樹菇、香菇、木耳、金針菇5 種食用菌多糖的理化性質(zhì)和免疫活性，為食用菌的開發(fā)利用提供理論支持。方法：采用水提醇沉法提取多糖；采用分光光度法、高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、紅外光譜法（infrared spectrometry，IR）分析多糖的理化性質(zhì)；采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定多糖的免疫活性。結(jié)果：相同條件下，5 種食用菌多糖提取率依次為平菇多糖（Pleurotus ostreatus polysaccharides，POP）3.39%、茶樹菇多糖（Agrocybe chaxingu polysaccharides，ACP）2.71%、金針菇多糖（Flammulina velutipes polysaccharides，F(xiàn)VP）2.69%、香菇多糖（Lentinus edodes polysaccharides，LEP）2.32%和木耳多糖（Auriculari aauricular polysaccharides，AAP）2.31%，它們均由分子質(zhì)量不同、糖苷鍵為β-構(gòu)型的多糖組分組成，均含有甘露糖（mannose，Man）、葡萄糖（glucose，Glc）和半乳糖（galactose，Gal）殘基，且ACP還含有鼠李糖（rhamnose，Rha）和阿拉伯糖（arabinose，Ara），AAP還含有少量的木糖（xylose，Xyl）；甲基化分析顯示不同多糖具有不同的糖苷鍵連接方式，POP和LEP以→1，3-β-Glc和→1，6-β-Glc為主要連接方式，ACP以→1，6-β-Glc和→1，6-β-Gal為主要連接方式，而AAP和FVP是以→1，4-β-Glc為主要連接方式；體外免疫活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5 種多糖在25～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)無細(xì)胞毒性，可不同程度地提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力和促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的能力，其中以→1，3-β-Glc和→1，6-β-Glc為主要連接方式的LEP活性最強(qiáng)，以→1，3-β-Glc和→1，6-β-Glc為主要連接方式的POP次之，以→1，6-β-Glc和→1，6-β-Gal為主要連接方式的ACP效果一般，以→1，4-β-Glc為主要連接方式的AAP和FVP效果最差。結(jié)論：5 種食用菌多糖具有不同的理化性質(zhì)和對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性，且活性大小與多糖是否含有→1，3-β-Glc和→1，6-β-Glc連接方式相關(guān)。

食用菌；多糖；理化性質(zhì)；巨噬細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)

食用菌是指子實(shí)體碩大、可供食用的大型真菌［1］，通稱為蘑菇，多屬擔(dān)子菌亞門。中國(guó)的食用菌資源十分豐富，是最早栽培和利用食用菌的國(guó)家之一［2］。大量研究已經(jīng)證實(shí)，多糖是食用菌的主要活性成分［3］，具有抗氧化［4-5］、調(diào)節(jié)免疫力［6-7］、抗腫瘤［8-9］、降血糖［10-11］、抗炎［12］等多種功效。常見的食用菌種類很多，已有的報(bào)道主要是單種食用菌多糖提取工藝和生物活性的研究，由于提取條件和活性評(píng)價(jià)體系不同，不同食用菌多糖的理化性質(zhì)和生物活性是否相同無法直接比較，因此限制了不同食用菌的合理開發(fā)。本實(shí)驗(yàn)以平菇、茶樹菇、香菇、木耳、金針菇5 種最常見的食用菌為代表，在相同條件下提取多糖，并對(duì)它們的理化性質(zhì)和和免疫活性進(jìn)行對(duì)比研究，以期為它們的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

平菇、茶樹菇、香菇、木耳、金針菇新鮮子實(shí)體購(gòu)于合肥市家樂福超市。

SPF級(jí)雌性昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（皖）2011-002。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、不同單糖標(biāo)準(zhǔn)品、臺(tái)盼藍(lán)、碘甲烷美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司；Hank's液、青霉素、鏈霉素 北京Solarbio科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒 美國(guó)R&D公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

LGJ-18S型原位冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；CT15RT型高速冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；V-1100型可見光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；MCO-17AIC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱日本Sanyo公司；Model680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；1260Infinity型高效液相色譜儀、7890A型氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；Paragon-1000型紅外光譜儀 美國(guó)PE公司；GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.3方法

1.3.1多糖的制備

5 種食用菌經(jīng)粉碎干燥、乙醇浸提后，將干燥的殘?jiān)粤弦罕?∶40（m/V）加蒸餾水80 ℃條件下重復(fù)提取2 次，每次2 h。提取的濾液合并，60 ℃條件下濃縮后離心，取上清液經(jīng)終體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇過夜沉淀、脫蛋白、透析（截留分子質(zhì)量為3 500 D）、冷凍干燥后分別得平菇多糖（Pleurotus ostreatus polysaccharides，POP）、茶樹菇多糖（Agrocybe chaxingu polysaccharides，ACP）、香菇多糖（Lentinus edodes polysaccharides，LEP）、木耳多糖（Auriculari aauricular polysaccharides，AAP）和金針菇多糖（Flammulina velutipes polysaccharides，F(xiàn)VP）。

1.3.2多糖的理化特性分析

5 種食用菌多糖的多糖含量、蛋白質(zhì)含量以及特性黏度分別采用苯酚-硫酸法［13］、考馬斯亮藍(lán)法［14］和一點(diǎn)法［15］測(cè)定。多糖的分子質(zhì)量采用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測(cè)定，色譜柱和色譜條件參照文獻(xiàn)［16］的方法。多糖的紅外光譜分析以及單糖組成和甲基化分析參照文獻(xiàn)［16］的方法進(jìn)行。

1.3.3多糖的免疫活性測(cè)定

按文獻(xiàn)［17］的方法制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL。分別取96 孔培養(yǎng)板，每孔加入90 μL或180 μL純化的腹腔巨噬細(xì)胞懸液和10 μL或20 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組分別以RPMI-1640培養(yǎng)基和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（30 μg/mL）代替樣品溶液，每組均設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。共同培養(yǎng)24 h后，按文獻(xiàn)［18］的方法測(cè)定巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬作用，按酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒操作規(guī)程測(cè)定TNF-α、IL-1β含量，按硝酸還原酶法試劑盒說明書方法測(cè)定NO的生成量。

1.3.4不同多糖的免疫活性比較

采用均一化計(jì)算模長(zhǎng)法，對(duì)5 種食用菌多糖的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行比較。設(shè)置4 個(gè)向量Xi（i=1、2、3、4；X1～X4分別代表TNF-α、IL-1β、NO和吞噬能力4 項(xiàng)原始指標(biāo)與相應(yīng)對(duì)照組的比值），根據(jù)模長(zhǎng)公式計(jì)算||X||2。數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。

||X||2=［X1/（X1+X2+X3+X4）］2+［X2/（X1+X2+X3+ X4）］2+［X3/（X1+X2+X3+X4）］2+［X4/（X1+X2+X3+X4）］2

2　結(jié)果與分析

2.15 種食用菌多糖的理化性質(zhì)

表1　5 種食用菌多糖的理化特性Table1　Physicochemical properties of the polysaccharides extracted from five edible mushrooms

經(jīng)相同條件水提醇沉后，平菇、茶樹菇、金針菇、香菇、木耳的多糖提取率分別是3.39%、2.71%、2.69%、2.32%和2.31%，說明不同食用菌的水溶性多糖含量不同。由表1可知，5 種食用菌多糖的碳水化合物含量均在75%以上，都有一定含量的蛋白質(zhì)和糖醛酸，它們的特性黏度大小依次是木耳多糖（AAP）＞金針菇多糖（FVP）＞平菇多糖（POP）＞香菇多糖（LEP）＞茶樹菇多糖（ACP）。HPGPC結(jié)果表明，5 種食用菌多糖均由分子質(zhì)量不同的組分所組成，分子質(zhì)量的分布范圍具有相似性（圖1）。紅外光譜分析顯示，5 種食用菌多糖均在3 400、2 930、1 650、1 250 cm-1附近具有典型的多糖特征吸收峰，在1 080 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰表明5 種多糖均含有吡喃型糖殘基，在880 cm-1附近的吸收峰表明5 種多糖的糖苷鍵連接方式均為β-構(gòu)型（圖2）。單糖組成分析（表1）表明，不同食用菌多糖具有不同的單糖組成，它們除含有不同比例的Man、Glc和Gal外，ACP還含有Rha和Ara，AAP還含有少量的Xyl。甲基化分析（表2）顯示，5 種食用菌多糖單糖殘基間的糖苷鍵連接方式表現(xiàn)出很大的差異，POP和LEP以β-（1→3）-D-Glc和β-（1→6）-D-Glc為主要連接方式，ACP以β-（1→6）-D-Glc和β-（1→6）-D-Gal為主要連接方式，而AAP和FVP是以β-（1→4）-D-Glc為主要連接方式。

圖1　5 種食用菌多糖的HPGPC圖Fig.1　HPGPC profiles of the polysaccharides extracted from five edible mushrooms

圖2　5 種食用菌多糖的紅外光譜圖Fig.2　FT-IR profiles of the polysaccharides extracted from five edible mushrooms

表2　5 種食用菌多糖的甲基化分析數(shù)據(jù)Table2　Methylation analysis of the polysaccharides extracted from five edible mushrooms

2.25 種食用菌多糖的免疫活性比較

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體天然免疫防線的重要組成部分，當(dāng)其被激活后，細(xì)胞體積增大，酸性水解酶活性提高，殺傷細(xì)菌和吞噬消化異物能力增強(qiáng)［19］。由圖3可知，在25～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5 種食用菌多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的作用呈低質(zhì)量濃度促進(jìn)、高質(zhì)量濃度抑制的“鐘罩型”劑量依賴關(guān)系，但它們促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力的最有效質(zhì)量濃度不同，LEP的有效質(zhì)量濃度是50 μg/mL，POP、AAP和FVP的有效質(zhì)量濃度是100 μg/mL，ACP的有效質(zhì)量濃度是200 μg/mL。與空白對(duì)照組相比，POP、ACP、LEP、AAP和FVP 5 種多糖在各自最有效質(zhì)量濃度時(shí)，巨噬細(xì)胞的吞噬能力分別提高了1.06、0.88、1.03、0.78、0.52 倍。

圖3　5 種食用菌多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.3　Effects of the polysaccharides extracted from five edible mushrooms on the phagocytosis of peritoneal macrophages

圖4　5 種食用菌多糖刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO量Fig.4　Effects of the polysaccharides extracted from five edible mushrooms on the release of NO by peritoneal macrophages

NO的合成與釋放增加是巨噬細(xì)胞被激活參與免疫反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)［20-21］。如圖4所示，在25～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5 種食用菌多糖對(duì)巨噬細(xì)胞釋放NO的作用表現(xiàn)不同，POP、LEP和AAP對(duì)巨噬細(xì)胞合成NO的促進(jìn)作用隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，而ACP和FVP對(duì)巨噬細(xì)胞合成NO的作用呈低質(zhì)量濃度促進(jìn)、高質(zhì)量濃度抑制的劑量依賴關(guān)系，ACP和FVP的最佳作用質(zhì)量濃度分別是200 μg/mL和100 μg/mL。與空白對(duì)照組相比，POP、ACP、LEP、AAP和FVP 5 種多糖在各自最有效質(zhì)量濃度時(shí)，巨噬細(xì)胞合成NO的能力分別提高了0.84、0.70、1.10、0.49、0.61 倍。

由圖5可知，作為一種由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子［22］，TNF-α的表達(dá)與分泌可不同程度地被5 種食用菌多糖所激活。在25～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，POP、LEP和FVP刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的最佳作用質(zhì)量濃度分別是200、200、100 μg/mL，而ACP和 AAP對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的促進(jìn)作用隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。與空白對(duì)照組相比，POP、ACP、LEP、AAP和FVP 5 種多糖在各自最有效質(zhì)量濃度時(shí)，巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的能力分別提高了0.81、0.74、0.83、0.62、0.46 倍。

圖5　5 種食用菌多糖刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNFF--α的影響Fig.5　Effects of the polysaccharides extracted from five edible mushrooms on the secretion of TNF-α by peritoneal macrophages

圖6　5 種食用菌多糖刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL--11β的影響Fig.6　Effects of the polysaccharides extracted from five edible mushrooms on the secretion of IL-1β by peritoneal macrophages

IL-1β也是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生、并參與免疫應(yīng)答反應(yīng)的一種重要細(xì)胞因子［23］。由圖6可知，在25～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5 種食用菌多糖對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β能力的影響均呈低質(zhì)量濃度促進(jìn)、高質(zhì)量濃度抑制的劑量依賴關(guān)系，其中ACP的有效質(zhì)量濃度是50 μg/mL，LEP、AAP和FVP的有效質(zhì)量濃度是100 μg/mL，POP的有效質(zhì)量濃度是200 μg/mL。POP、ACP、LEP、AAP和FVP 5 種多糖在各自有效作用質(zhì)量濃度下，巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的能力分別比空白對(duì)照組提高了0.47、0.32、0.51、0.29、0.20 倍。

基于上述巨噬細(xì)胞吞噬中性紅、合成NO以及分泌TNF-α和IL-1β能力的變化，進(jìn)一步采用均一化計(jì)算模長(zhǎng)的數(shù)學(xué)方法，對(duì)5 種食用菌多糖的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。在25～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，LEP在400 μg/mL時(shí)的模長(zhǎng)||X||2最大為0.849，將其他4 種多糖各質(zhì)量濃度的模長(zhǎng)進(jìn)行方差分析顯示，POP除25 μg/mL外，其余質(zhì)量濃度與LEP（400 μg/mL）無顯著差異；ACP除200 μg/mL外，其余質(zhì)量濃度與LEP（400 μg/mL）均有極顯著差異（P＜0.01），AAP和FVP所有質(zhì)量濃度與LEP（400 μg/mL）均有極顯著差異（P＜0.01），以上結(jié)果表明5 種多糖的免疫調(diào)節(jié)活性大小依次是LEP＞POP＞ACP＞AAP＞FVP。

表3　5 種食用菌多糖的免疫活性比較Table3　Immunomodulating activity of the polysaccharides extracted from five edible mushrooms

參考5 種多糖的甲基化分析結(jié)果（表2），可以發(fā)現(xiàn)免疫活性最好的LEP和POP以β-（1→3）-D-Glc和β-（1→6）-D-Glc為主要連接方式，免疫活性一般的ACP以β-（1→6）-D-Glc和β-（1→6）-D-Gal為主要連接方式，而免疫活性較差的AAP和FVP是以β-（1→4）-D-Glc為主要連接方式。5 種食用菌多糖具有不同的免疫調(diào)節(jié)活性與多糖的單糖間的糖苷鍵連接方式相關(guān)，其中多糖是否含有→1，3-β-Glc和→1，6-β-Glc連接方式對(duì)其免疫活性具有重要影響。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)5 種食用菌多糖的理化特性和免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明5 種食用菌多糖分子質(zhì)量、單糖組成和糖苷鍵連接方式各不相同，但均為β-構(gòu)型的多糖，5 種食用菌多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫功能均具有一定的調(diào)節(jié)作用，其中香菇多糖LEP和平菇多糖POP的作用最強(qiáng)，茶樹菇多糖ACP的效果較好，木耳多糖AAP和金針菇多糖FVP的作用一般。理化特性和免疫活性的關(guān)聯(lián)分析表明，5 種食用菌多糖是否表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫活性與多糖是否含有→1，3-β-Glc和→1，6-β-Glc連接方式相關(guān)。

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Physicochemical Properties and Immunomodulating Activities of Polysaccharides from Five Species of Edible Mushrooms

LIU Su， JIANG Yue， LUO Jianping*， PAN Lihua， ZHA Xueqiang
（School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China）

Objective： To investigate the physicochemical properties and immunomodulating activities of different edible mushroom polysaccharides. Methods： Water extraction-ethanol precipitation method was employed to isolate mushroom polysaccharides. Spectrophotometry， high performance gel permeation chromatography （HPGPC）， gas chromatographymass spectrometry （GC-MS）， infrared spectrometry （IR） and enzyme-linked immunosor bent assay （ELISA） were using to analyze the physicochemical properties and immunomodulatory activities of mushroom polysaccharides. Results：Under the same conditions， the descending order of extraction rate of five mushroom polysaccharides was Pleurotus ostreatus polysaccharides （POP）， Agrocybe chaxingu polysaccharides （ACP）， Flammulina velutipes polysaccharides（FVP）， Lentinus edodes polysaccharides （LEP） and Auriculari aauricular polysaccharides （AAP）. These polysaccharides from five different mushrooms had different molecular mass distributions. All the polysaccharides consisted of mannose（Man）， glucose （Glc） and galactose （Gal） with β-configuration although ACP also contained rhamnose （Rha） and arabinose（Ara） and AAP contained a small quantity of xylose （Xyl）. Methylation analysis indicated that different polysaccharides had different glucosidic linkage types. The main glucosidic linkage types of POP and LEP consisted of →1，3-β-Glc and →1，6-β-Glc whereas those of ACP consisted of →1，6-β-Glc and →1，6-β-Gal and those of AAP and FVP consisted of→1，4-β-Glc. In vitro experiment results showed that the five mushroom polysaccharides had no cytotoxicity at theconcentration ranging from 25 to 400 μg/mL， could improve the phagocytic capacity of mouse peritoneal macrophages and promote the secretion of NO， TNF-α and IL-1β from macrophages. Among all tested polysaccharides， LEP containing →1，3-β-Glc and →1，6-β-Glc showed the strongest immunomodulating activity followed in a descending order by POP containing →1，3-β-Glc and →1，6-β-Glc， ACP containing→1，6-β-Glc and→1，6-β-Gal， AAP and FVP containing→1，4-β-Glc. Conclusions： These five mushroom polysaccharides had different physicochemical properties and immunomodulating activities. Their immunomodulating activities depended on the existence of →1，3-β-Glc and →1，6-β-Glc.

edible mushroom； polysaccharides； physicochemical properties； macrophages； immunomodulation

S646

A

1002-6630（2015）13-0252-05

10.7506/spkx1002-6630-201513047

2014-08-11

劉蘇（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)橹胁菟幣c功能食品。E-mail：liusu0203@163.com

羅建平（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹胁菟幣c功能食品。E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn