頸動脈分叉部動脈瘤模型的建立

王玨，趙玉武，朱悅琦，李菁

·實驗研究Experimental research·

頸動脈分叉部動脈瘤模型的建立

王玨，趙玉武，朱悅琦，李菁

目的探討建立犬頸動脈分叉部動脈瘤模型的可行性。方法建立18只犬新的頸總動脈（CCA）分叉部動脈瘤模型，隨機分為分叉部頂端彈性蛋白酶處理組（實驗組，n=9）和生理鹽水處理組（對照組，n=9）。術(shù)后即刻、12周和24周分別行血管造影觀察動脈瘤頂端形態(tài)變化，術(shù)后12周和24周分別行組織病理學分析。結(jié)果血管造影顯示實驗組中5只模型動脈分叉頂部觀察到新生動脈瘤形成，平均直徑（3.2±0.4）mm，對照組中所有模型分叉部頂端均未觀察到有新生動脈瘤形成。實驗組中新生動脈瘤在隨訪過程中未見到動脈瘤破裂。組織病理學分析顯示實驗組中分叉部頂端動脈瘤表現(xiàn)為內(nèi)彈力膜不連續(xù)、彈力纖維斷裂、肌層變薄、平滑肌細胞減少（與對照組相比，P＜0.001）。結(jié)論犬重建頸動脈分叉頂端經(jīng)彈力酶消化所致動脈壁退化可引起新生動脈瘤形成。

動脈瘤；動物模型；頸動脈

動脈瘤是動脈內(nèi)腔局限性異常擴大所致動脈壁的異常瘤狀突出。其中血管分叉部動脈瘤如顱內(nèi)動脈瘤有著較高的患病率［1］，且能引起致命性蛛網(wǎng)膜下腔出血。但其發(fā)生發(fā)展、破裂的具體機制，目前尚未明確［2-3］。動脈瘤發(fā)生發(fā)展、破裂機制研究，有賴于建立動脈瘤動物模型，然而僅少數(shù)動物模型較滿意地模擬了分叉部動脈瘤的發(fā)生和生長［4-6］。因此，我們設(shè)計并建立一種新的犬頸動脈分叉模型，從血管造影和組織病理水平動態(tài)觀察動脈瘤發(fā)生和生長。

1　材料與方法

1.1實驗動物

本研究所有方案均經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院動物研究委員會批準，并遵循國際動物保護協(xié)會的指導方針。實驗采用18只8個月大的比格犬，體重為12～20 kg（由上海交通大學農(nóng)學院提供，許可證：SCXK2007-0004）。

1.2彈性蛋白酶作用濃度和孵化時間的初篩研究

在無菌條件下，為3只犬行前下頸部正中切口，暴露和分離雙側(cè)頸總動脈（CCA），長度均為8～10 cm。在每一側(cè)CCA中選取長度約1 cm的3段，對其外壁用彈性蛋白酶（1號犬0.75 u/μl，2號犬1.5 u/μl，3號犬3.0 u/μl）分別處理10、15、30 min。每個培育時間內(nèi)取6個樣本進行組織病理學觀察分析，依據(jù)結(jié)果選擇最佳彈性蛋白酶濃度和時間。CCA壁退化程度依據(jù)組織病理學進行分級：0級為無中膜彈力纖維損傷，內(nèi)彈性膜（IEL）完整（-）；Ⅰ級為中膜彈力纖維損傷，IEL完整（+）；Ⅱ級為中膜彈力纖維損傷，IEL不連續(xù)（++）；Ⅲ級為中膜彈力纖維損傷，IEL不連續(xù)，動脈壁結(jié)構(gòu)破壞（+++）。每個斷面的彈力纖維的破壞程度，由3名病理學家分別獨自評分后確定。

1.3CCA分叉部動脈瘤模型建立

無菌條件下行犬前下頸部正中切口，暴露和分離雙側(cè)CCA各約10 cm。右側(cè)CCA近端結(jié)扎，遠端暫時性阻斷，然后于結(jié)扎點遠心端離斷血管；左側(cè)CCA兩端阻斷血流后中段離斷。以肝素化生理鹽水，用帶鈍頭針的注射器沖洗游離血管段，保持切緣規(guī)整。然后對游離的右側(cè)遠心端CCA與左側(cè)遠心端CCA，用8-0縫線行端-端吻合，吻合血管中段切開后再與左側(cè)近心端CCA作端-側(cè)吻合，從而建立Y型血管分叉模型。血管夾松開并觀察吻合口處無出血后，分層縫合頸部切口。18只犬的血管分叉模型建立后，隨機分為分叉部頂端彈性蛋白酶處理組（實驗組，n=9）和生理鹽水處理組（對照組，n=9），每組有6只雌性和3只雄性。以彈性蛋白酶（3.0 u/ μl）處理實驗組中9個重建的血管模型分叉部頂端15 min，面積約4 mm×4 mm。對照組模型分叉部頂端以同樣方法用生理鹽水處理。彈力蛋白酶孵化前，盡量多地去除血管外膜，以方便彈性蛋白酶滲透。

1.4血管造影

于模型構(gòu)建后即刻、12周和24周分別行血管造影檢查。右側(cè)股動脈插管，采用4 F導管（美國Cook醫(yī)療公司）行選擇性CCA造影，還施行三維DSA成像觀察血管分叉頂部形態(tài)改變。如果動脈瘤樣囊泡形成，從二維和三維DSA圖像上測量瘤頸、瘤體直徑和載瘤動脈直徑。將瘤體最大徑超過鄰近動脈直徑的一半，視為動脈瘤形成。術(shù)后第4周和第8周采用超聲動態(tài)監(jiān)測動脈瘤是否形成及其大小，觀察重建血管通暢情況。

1.5組織病理學檢查

實驗組和對照組預實驗和術(shù)后獲得的重建CCA分叉樣本分別在術(shù)后12周后（n=6）和24周后（n=3）取出，均在中性緩沖液甲醛中固定＞48 h，經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片（厚度4 μm）后行HE染色、Masson染色和彈力纖維染色，以評估重建血管分叉部組織學改變。每個樣本至少有3個切片包括的完整血管分叉部，選擇最佳切片用作病理學家評分。用EnVision技術(shù)以抗小鼠增殖細胞核抗原（PCNA）抗體NeoMarkers（1∶100，美國Thermo Fisher科技公司）、小鼠α單克隆平滑肌肌動蛋白抗體（1∶50，美國Santa Cruz生物技術(shù)公司）行免疫組化染色觀察。測量平滑肌細胞增殖速率（PCNA陽性平滑肌細胞所占比例）、彈力層和肌動蛋白陽性平滑肌層厚。如果細胞核染色超過50%，即認為是陽性細胞。病理圖片分別放大40、100、400倍觀察。用Image-Pro Plus 6.0版圖像分析軟件分析組織病理學圖像（美國Media Cybernetics公司），每個切片的血管間質(zhì)區(qū)域放大400倍后至少隨機選擇20個。每個病理切片均由3名病理學家以盲法分別獨自評分。

1.6統(tǒng)計分析

用GraphPad Prism 5.0版軟件（美國San Diego公司）進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)變量用平均值±標準差表示，數(shù)值變量以數(shù)量或百分比表示。用確切概率法（Fisher檢驗）比較分類資料，組間t檢驗比較平滑肌細胞增殖速率、彈力層、肌動蛋白陽性平滑肌層厚。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1體內(nèi)彈性蛋白酶暴露預實驗

HE染色、Masson染色和彈力纖維染色結(jié)果證明，暴露在1.5 u/μl彈性蛋白酶30 min或3.0 u/μl中15 min，均可有效地損傷中膜彈力纖維，導致IEL結(jié)構(gòu)不完整。低濃度彈性蛋白酶和較短的暴露時間不能有效損傷IEL，更長暴露時間可能會導致血管肌層過度消化；因此，我們在手術(shù)模型中使用彈性蛋白酶濃度為3.0 u/μl，孵育時間15 min（表1、圖1）。

2.2CCA分叉部動脈瘤模型及血管造影結(jié)果

CCA分叉部動脈瘤模型在全部動物中均成功建立。超聲或血管造影隨訪均顯示吻合口無狹窄、無載瘤動脈閉塞。血管造影顯示實驗組9只模型犬中5只可在動脈分叉頂部觀察到新生動脈瘤形成，其中4只為母犬，1只為公犬（P＞0.05）。二維和三維DSA均顯示動脈瘤位置位于分叉頂部，形態(tài)為寬基底型，瘤體平均直徑（3.2±0.4）mm，瘤頸平均直徑（6.7±2.3）mm，（圖2）。實驗組隨訪24周后未觀察到動脈瘤破裂，較12周時僅有輕度增大，為（3.5±0.3）mm對（3.0±0.2）mm，P=0.076。超聲監(jiān)測于4周時均已發(fā)現(xiàn)所有新生動脈瘤。

表1　預實驗中犬CCA暴露在不同濃度和時間的彈性蛋白酶下組織病理學改變

圖1　不同濃度彈性蛋白酶和暴露時間影響活體預實驗中犬CCA之IEL連續(xù)性

2.3動脈壁組織病理學改變

在形成動脈瘤的5個CCA分叉樣本中，活體組織觀察發(fā)現(xiàn)整個血管壁變薄，成為半透明狀態(tài)，并能觀察到內(nèi)部血流，以致易引起變薄的血管壁膨出，分叉部動脈瘤形成。

HE染色、Masson染色顯示實驗組分叉部中膜變薄，平滑肌細胞減少，纖維連接缺失。彈力纖維染色顯示實驗組中IEL不連續(xù)，彈力纖維斷裂；對照組中只有3只動物動脈分叉頂部出現(xiàn)內(nèi)膜輕度損傷。

免疫組化染色顯示，實驗組中彈性蛋白酶處理過的動脈分叉頂部血管壁SMA陽性的平滑肌細胞數(shù)量減少，PCNA陽性的平滑肌細胞比例明顯增加，平滑肌層變薄。

3　討論

為進一步研究動脈瘤發(fā)生和生長機制，本研究建立動物模型，分析血管性病變的發(fā)展。先前已有相關(guān)模型報道，主要是在犬或豬頸動脈用靜脈移植法構(gòu)建血管分叉。這些模型主要用于指導治療及評估治療后血管組織病理學改變［7-8］。許多研究對動脈分叉處動脈瘤形成原因進行了分析，但模擬動脈瘤生長的較滿意動物模型為數(shù)不多［5-6，9-10］。2007年，Meng等［5］通過在犬頸動脈建立血管分叉模型發(fā)現(xiàn)，血管高壁面切應力（WSS）或壁面切應力梯度（WSSG）與組織學損傷有關(guān)，而動脈瘤并沒有發(fā)展，需要進一步研究確認觀察到的組織學改變是否會引發(fā)動脈瘤。2008年，Gao等［4］通過結(jié)扎兔子雙側(cè)頸內(nèi)動脈并增加血流動力學壓力引發(fā)了顱內(nèi)新生動脈瘤，認為血流動力學壓力增加導致動脈瘤發(fā)生，與基底動脈血流增加有關(guān)；然而由于兔血管纖細，傳統(tǒng)顱內(nèi)血管造影及其他放射性手段并不能顯示其結(jié)構(gòu)改變。

圖2　術(shù)后二維和三維DSA隨訪圖像和大體解剖圖

大型流行病學調(diào)查顯示，動脈瘤尤其是顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生與許多先天及后天因素，如遺傳、血流動力學、年齡、性別、抽煙、高血壓及動脈硬化等有關(guān)［11-12］。除持續(xù)血流因素外，許多研究證明血管壁退化是顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生最重要的一步［13］。血管分叉頂端與大血管不同，管壁肌層缺失。另外，顱內(nèi)血管外彈力層易損或缺失及周圍腦脊液分布，均會導致其易被機械力損傷［13-14］。由此推斷，血管壁結(jié)構(gòu)異常及膠原纖維和彈力纖維的缺失是動脈瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素［15］。

本研究通過彈性蛋白酶誘導IEL和中膜彈力纖維損傷，從而導致血管壁退化。采用Meng方法，重建CCA血管分叉以模仿血流動力學環(huán)境，通過結(jié)扎對側(cè)CCA增加血流［5］。此前已有彈性蛋白酶誘導的小鼠、大鼠和兔子模型建立［10］，但用于有效損傷犬CCA的IEL及彈力纖維的彈性蛋白酶濃度不得而知。我們設(shè)計一項活體預實驗，用于選擇合適的彈性蛋白酶濃度損傷IEL及中膜彈力纖維，同時不損傷平滑肌細胞。由于預實驗中血管壁內(nèi)膜彈性蛋白酶損傷后極易導致血栓形成，我們以外膜為對象選擇性損傷IEL和彈力纖維，模擬動脈壁退化。其中，去除盡可能多的外膜加強彈性蛋白酶滲透很關(guān)鍵。

目前大多數(shù)研究均采用小動物研究動脈瘤形成的相關(guān)機制［4-6，10］。盡管小動物血壓和血流速度與人類相仿，但血管結(jié)構(gòu)尤其是動脈壁肌層不盡相同。因此，小動物上建立動脈瘤模型不一定適用于大型動物。本實驗使用犬模型來模擬人類血管，因為其血流動力學更接近于人類［16］。犬CCA較長（10～12 cm），為重建血管分叉提供了有利條件；犬CCA和人類ICA管徑相仿，直徑約4 mm；犬顱內(nèi)血管供應大多來自椎基底動脈系統(tǒng)，再加上與ICA血管網(wǎng)的吻合［17］，可以防止雙側(cè)CCA暫時夾閉后發(fā)生缺血致死；此外，犬類CCA細胞組成及蛋白聚糖排列與人類相同［18］，這意味著犬動物模型可以準確預測人體對于危險因素的生理反應。

經(jīng)過24周隨訪，實驗組中5/9成功誘發(fā)動脈瘤，均經(jīng)血管造影及組織病理學分析確認。我們假設(shè)動脈瘤退化，加上血流動力學改變，會有效地誘發(fā)動脈瘤。血管分叉頂部受損的血管壁對血流、血壓和軸向拉伸會產(chǎn)生反應性改變。彈性蛋白酶作用區(qū)域的大小決定了瘤頸較寬、瘤體較小的動脈瘤形成，這些動脈瘤被視作早期動脈瘤。然而，這些早期動脈瘤與人類動脈瘤有相近的組織病理學改變：①IEL不連續(xù)，中部彈力層及平滑肌層層厚變??；②中部平滑肌層有退化、變薄及損傷；③平滑肌細胞增殖減少。在對照組，3只動物對持續(xù)性血流動力學行為有著相同改變，但只有內(nèi)膜損傷和IEL不連續(xù)可在彈力纖維缺失或中膜平滑肌細胞受損的動物中觀察到。本研究模型還有個特點，即12周后血管造影或組織學檢查均無血栓形成。這表明本實驗中彈性蛋白酶作用于血管分叉部外膜，使得內(nèi)膜完整，從而避免在CD39、一氧化氮、前列環(huán)素作用下血小板聚集和血栓形成［19］。

然而，本研究建立的犬CCA分叉部動脈瘤模型不能完全代表真正的顱內(nèi)動脈瘤模型。因為相較顱外動脈，顱內(nèi)動脈有以下特定的解剖和生理特點，本模型無法完全符合之：顱內(nèi)動脈內(nèi)膜層厚，內(nèi)彈力層發(fā)達，而中膜和外膜較薄，僅有少量彈力纖維，沒有外彈力膜，平滑肌細胞比例較??；其中最重要的是其受所處腦脊液環(huán)境的影響。

綜上所述，本模型設(shè)計針對性強，制作規(guī)范，實用性高，可用于進一步研究血流動力學、基因、蛋白或生理通道等對動脈瘤發(fā)生發(fā)展、破裂的作用。

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The establishment of aneurysm model at the carotid artery bifurcation in experimental dogs

WANGJue，ZHAO Yu-wu，ZHU Yue-qi，LI Jing.School of Medicine，Soochow University，Suzhou，Jiangsu Province 215123，China

ZHAO Yu-wu，E-mail：zhaoyuwu6@163.com

ObjectiveTo investigate the feasibility of establishing aneurysm model at the carotid artery bifurcation in experimental dogs.MethodsNew aneurysm model at the common carotid artery（CCA）bifurcation was established in 18 experimental dogs，which were randomly and equally divided into study group（n=9）and control group（n=9）.In the dogs of the study group，the bifurcation top was treated with elastase，while in the dogs of the control group the bifurcation top was treated with saline.Angiography was separately performed immediately after，and at 12 and 24 weeks after the operation to observe the changes of the aneurysm top.Pathological examination was separately carried out at 12 and 24 weeks after the operation. ResultsAngiography showed that nascent aneurysm formation（mean diameter of 3.2±0.4 mm）was demonstrated at the arterial bifurcation top in 5 dogs of the study group；while no nascent aneurysm at the arterial bifurcation top was observed in the control group.During the follow-up period，no rupture of the nascent aneurysm occurred in the study group.Pathological examination revealed that discontinued internal elastic membrane，elastic fiber fracture，thinning muscle layer and reduction of smooth muscle cells were detected in the aneurysm at bifurcation top in the study group；when compared with those in the control group，the difference was statistically significant（P＜0.001）.ConclusionThe elastase-induced digestive degeneration of artery wall can cause new aneurysm formation in the newly-established aneurysm located at carotid artery bifurcation in experimental dogs.（J Intervent Radiol，2015，24：231-235）

aneurysm；animal model；carotid artery

R543.5

A

1008-794X（2015）-03-0231-05

2014-09-22）

（本文編輯：邊佶）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.03.012

215123蘇州大學醫(yī)學部（王玨、趙玉武）；上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院介入影像科（朱悅琦、李菁）

趙玉武E-mail：zhaoyuwu6@163.com