骨水泥對兔脊柱VX2腫瘤轉移模型的作用研究

黃昊，何仕誠，馮國棟，杜瑞杰，朱海東，方文，郭金和，鄧鋼

骨水泥對兔脊柱VX2腫瘤轉移模型的作用研究

黃昊，何仕誠，馮國棟，杜瑞杰，朱海東，方文，郭金和，鄧鋼

目的探討聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥對兔脊柱VX2腫瘤的殺傷作用。方法成功建立兔VX2脊柱轉移腫瘤模型18只，隨機分為A、B、C組，每組各6只，在CT導下向VX2腫瘤中心分別注入PMMA或生理鹽水，其中A組注入PMMA 0.3 ml、B組注入PMMA 0.1 ml、C組注入生理鹽水0.3 ml。術后24 h處死模型兔，A、B組分別于距離PMMA團塊邊緣1、5、10、15 mm處不同方向各取4個腫瘤組織塊，C組于瘤體中心至表面不同的4個位置各取1塊腫瘤組織，采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）法檢測腫瘤細胞凋亡率。結果16只模型兔成功注入PMMA骨水泥，A、B組手術成功率均為5/6，C組為6/6，無顯著性差異。A組距PMMA邊緣1、5、10 mm處腫瘤細胞平均凋亡率分別為（65.75±18.81）%、（50.00±14.24）%、（14.95±8.98）%，與對照組（9.79±5.24）%相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；15 mm處腫瘤細胞平均凋亡率為（10.30±8.13）%，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。B組距PMMA邊緣1、5 mm處腫瘤細胞平均凋亡率分別為（49.20±15.57）%、（17.75±9.28）%，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余觀測點無顯著性差異。A、B兩組距PMMA邊緣1、5、10 mm處腫瘤細胞平均凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。結論PMMA可促進腫瘤細胞凋亡，適量增加PMMA注入量可增加腫瘤細胞凋亡范圍。

聚甲基丙烯酸甲酯；兔；VX2腫瘤；脊柱轉移；凋亡

各種惡性腫瘤晚期發(fā)生脊柱轉移可達30%～70%，對其治療的主要目的是緩解局部疼痛、改善神經(jīng)功能、保持脊柱穩(wěn)定性，并盡可能控制局部病灶［1］。經(jīng)皮椎體成形術（PVP）經(jīng)過20余年發(fā)展已成為治療脊柱轉移瘤的重要手段，但術中所使用的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥是否對其周圍的腫瘤組織有殺傷作用，尚未得到肯定的驗證［1-3］。本研究在前期建立的可重復、較穩(wěn)定的兔脊柱腫瘤轉移模型基礎上，在經(jīng)CT導引下經(jīng)皮穿刺注入PMMA，以探究其對腫瘤的殺傷作用。

1　材料與方法

1.1材料

實驗取新西蘭大白兔25只（3～4月齡，體重2.5～3.5 kg，雌雄不限），由東南大學動物實驗中心提供（實驗動物許可證編號：SYXK蘇-2010-0004）。VX2腫瘤株由東南大學分子影像與功能影像實驗室提供，每隔4周經(jīng)兔大腿部肌肉成瘤傳代。實驗材料還包括乙二胺四乙酸（EDTA，武漢博士德生物工程有限公司）、蘇木精-伊紅（HE，上海碧云天生物技術有限公司）、4%甲醛（東南大學附屬中大醫(yī)院病理科）、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）試劑盒（瑞士Roche公司）。

1.2方法

1.2.1兔脊柱VX2腫瘤轉移模型的建立兔脊柱VX2腫瘤模型的建立和影像學評價方法參照凌龍等［2］報道。術后28 d行腰椎CT掃描檢查，觀測到兔椎體伴有明顯骨質破壞時視為建模成功（圖1①）。1.2.2實驗分組及手術步驟成功構建兔脊柱VX2腫瘤模型共計18只，隨機分為A、B、C組，每組6只。實驗手術于第28天施行，1%異戊巴比妥鈉（3 ml/kg）經(jīng)耳緣靜脈麻醉模型兔并固定行腰椎CT平掃，用18 G血管穿刺針在CT導引下穿刺入椎體中心，A、B兩組分別注入PMMA 0.3 ml和0.1 ml（圖1②③），C組為對照組（僅注入生理鹽水0.3 ml）。PMMA按臨床常用比例調配后120 s開始注入［3］。

1.2.3術后觀察與評價術后24 h為觀察終點，處死實驗兔后取出目標椎體，脫鈣后逐層切片，選取腫瘤侵蝕椎體面積最廣的層面進行觀察。實驗組于PMMA周圍4個方向，分別距PMMA邊緣1 mm（緊貼PMMA邊緣處）、5 mm、10 mm及15 mm處各取一腫瘤組織塊，對照組于瘤體中心至表面不同的4個位置各取一腫瘤組織塊，并行HE染色及TUNEL染色［4］后，檢測腫瘤細胞凋亡指數(shù)（AI）［5］。

1.3統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1手術情況

25只新西蘭大白兔中18只成功建立兔脊柱VX2腫瘤模型，建模成功率為72%（18/25）。注入PMMA前共有15只模型兔出現(xiàn)后肢癱瘓，A、B、C組各5只。

圖1　兔脊柱VX2腫瘤模型注入PMMA實驗

18只脊柱VX2腫瘤模型兔穿刺均獲成功，其中A、B實驗組共10只模型兔（10/12）成功注入PMMA，達到實驗預期終點。A組有4只模型兔椎體旁出現(xiàn)少量PMMA滲漏，術中麻醉死亡1只；B組椎體旁均無PMMA滲漏，術中麻醉死亡1只。對照組實驗均獲成功（6/6）。對照組與實驗組間手術成功率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.529）。術后所有存活實驗兔后肢情況與術前相同。

2.2組織學檢查

術后24 h共取出A、B組轉移瘤椎體各5節(jié)，C組轉移瘤椎體6節(jié)。組織HE染色結果見圖2，TUNEL熒光染色見圖3。術后距PMMA邊緣不同距離腫瘤細胞凋亡率見表1。A組距PMMA邊緣1、5、10 mm處腫瘤細胞平均凋亡率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而15 mm處腫瘤細胞平均凋亡率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義；B組距PMMA邊緣1、5 mm處腫瘤細胞平均凋亡率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余觀測點無統(tǒng)計學差異。A、B組距PMMA邊緣1、 5、10 mm處腫瘤細胞平均凋亡率比較，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

圖2　兔脊柱VX2腫瘤模型注入PMMA后病理表現(xiàn)

表1　VX2腫瘤不同位置標本細胞凋亡率

圖3　距PMMA邊緣不同距離VX2腫瘤標本的TUNEL染色熒光顯微鏡下表現(xiàn)（×400）

3　討論

3.1兔脊柱VX2腫瘤轉移模型注入PMMA方法

由于CT可準確顯示穿刺針進入靶椎體腫瘤骨質破壞區(qū)內(nèi)，故本實驗采用經(jīng)椎體側后緣與椎弓根交界處穿刺入路注入PMMA［2］，手術成功率分別為實驗組10/12、對照組6/6，組間無顯著性差異。我們檢索了Medline、中國萬方及知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，迄今未見有兔椎體內(nèi)注入骨水泥的相關研究報告，因而在本實驗前關于兔椎體內(nèi)應注入多少量骨水泥無經(jīng)驗可參考。為此，我們進行多次預實驗，發(fā)現(xiàn)兔腰椎內(nèi)PMMA注入量增加至0.5 ml時均有PMMA較多滲漏入椎管，而本實驗組PMMA滲漏發(fā)生率為40%（4/10），均發(fā)生于注入PMMA 0.3 ml的A組，提示隨著PMMA注入量增加，滲漏發(fā)生風險也隨之增大，故兔脊柱VX2腫瘤內(nèi)注入PMMA量不宜超過0.3 ml。

3.2PMMA對VX2腫瘤殺傷作用的評價

凋亡作為細胞死亡的形式之一，可在一定程度上反映細胞周圍環(huán)境刺激或變化的情況［6］。正?；蚍敝臣毎麤]有脫氧核糖核酸斷裂，不被TUNEL染色，因此本實驗采用TUNEL法［7］評價PMMA對腫瘤殺傷程度及范圍是切實可行的。

盡管PMMA對腫瘤細胞具有急性殺傷作用已被證實［8］，但殺傷程度及范圍是否與注射量相關，仍然無肯定結論。Wang等［9］研究發(fā)現(xiàn)，VX2腫瘤自然生長4周內(nèi)一般無明顯壞死（即細胞自然凋亡作用較?。彝眉棺祪?nèi)植入VX2腫瘤約28 d時CT可觀測到兔椎體伴有明顯骨質破壞［2］，故本實驗選擇在兔脊椎內(nèi)植入VX2腫瘤后第28天時注入PMMA并設置對照組，從而避免腫瘤細胞自然凋亡的干擾。通過本實驗可以推論，注入PMMA 0.1 ml對VX2腫瘤細胞的殺傷范圍為5～10 mm，而注入PMMA 0.3 ml則為10～15 mm。我們認為，在一定范圍內(nèi)增加PMMA注射量可增加對腫瘤細胞的殺傷作用。

Bhatt等［1］研究認為，PMMA對腫瘤的殺傷機制可能在于：①PMMA單體細胞毒作用；②PMMA聚合熱作用。然而本實驗中，B組中單體理論注射量僅為0.02 ml，且大部分已與PMMA粉劑聚合，PMMA 0.1 ml注射后腫瘤細胞凋亡范圍約為5 mm，因此僅用單體細胞毒性解釋其殺傷作用難以令人信服；PMMA 4 ml聚合時產(chǎn)生的最高溫度可達61℃［10］，增加PMMA注射量可增加其與腫瘤的接觸面積，同時產(chǎn)生的總熱量（Q=Δt·m·c）也勢必增加，我們因而認為聚合熱對腫瘤起主要殺傷作用。Chen等［11］研究認為，血流及腦脊液流動會造成熱量散失，骨組織與軟組織之間熱傳導也存在差異，這些均會對腫瘤與脊髓的實際溫度產(chǎn)生影響，可見采用兔脊柱VX2腫瘤轉移模型研究PMMA對腫瘤的殺傷作用的可信度應更高。本實驗中A組1 mm處腫瘤細胞凋亡率與B組比較有顯著差異，提示增加PMMA注射量可提高腫瘤細胞凋亡率。

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The killing effect of bone cement on spinal metastasis of transplanted VX2 carcinoma in experimentalrabbit models

HUANG Hao，HE Shi-cheng，F(xiàn)ENG Guo-dong，DU Rui-jie，ZHU Hai-dong，F(xiàn)ANG Wen，GUO Jin-he，DENG Gang.Department of Radiology，Affiliated Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing，Jiangsu Province 210009，China

HE Shi-cheng，E-mail：shichenghe@vip.sina.com

ObjectiveTo investigate the killing effect of polymethylmethacrylate（PMMA）on spinal metastasis of transplanted VX2 carcinoma in experimental rabbit models.MethodsSpinal metastasis of transplanted VX2 carcinoma model was successfully established in 18 rabbits.The experimental rabbits were randomly and equally divided into three groups with 6 rabbits in each group.Under CT guidance，PMMA or saline was injected into the center of VX2 tumor；in group A 0.3 ml of PMMA was used，in group B 0.1 ml of PMMA was used and in group C（control group）0.3 ml saline was used.Twenty-four hours after the injection，the animals were sacrificed.Four tissue samples were obtained from the sites at 1 mm，5 mm，10 mm and 15 mm away from the PMMA mass in each rabbit of group A and group B，while four tissue samples were collected from different four sites from the tumor's center to border in each rabbit of group C. TdT-mediated dUTP nick-end labeling（TUNEL）method was used to determine the tumor cell apoptosis rate. ResultsAfter successful establishment of rabbit model，injection of PMMA was performed in sixteen amongthe eighteen rabbits.Technical success rates were 83.3%in both group A and B，and the success rate was 100%in group C.The difference in technical success rate was not significant.The mean tumor cell apoptosis rates of spinal VX2 carcinoma at 1 mm，5 mm and 10 mm away from the PMMA mass in group A were（65.75±18.81）%，（50.00±14.24）%and（14.95±8.98）%respectively.The mean apoptosis rate in the control group was（9.79±5.24）%；the differences between the group A and the control group were statistically significant（P＜0.05）.The mean tumor cell apoptosis rate of spinal VX2 carcinoma at 15 mm away from the PMMA mass in group A was（10.30±8.13）%，which was not significantly different with that of the control group.The mean tumor cell apoptosis rates of spinal VX2 carcinoma at 1 mm and 5 mm away from the PMMA mass in group B were（49.20±15.57）%and（17.75±9.28）%respectively，which was significantly different with that of the control group（P＜0.05）；the mean tumor cell apoptosis rates at 10 mm and 15 mm away from the PMMA mass in group B were not significantly different with those of the control group.Statistically significant differences in the mean tumor cell apoptosis rates determined at 1 mm，5 mm and 10 mm away from the PMMA mass existed between group A and group B（P＜0.001）.ConclusionPMMA can promote the apoptosis of tumor cells，properly increasing the injected amount of PMMA can enlarge the extent of tumor cell apoptosis.（J Intervent Radiol，2015，24：520-523）

polymethylmethacrylate；rabbit；VX2 carcinoma；spinal metastasis；apoptosis

R681.5

A

1008-794X（2015）-06-0520-04

2014-11-27）

（本文編輯：邊佶）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.06.013

國家自然科學基金（81171434）、江蘇省臨床醫(yī)學科技專項項目（BL2013029）

210009南京東南大學附屬中大醫(yī)院放射科（黃昊、馮國棟、杜瑞杰）、介入與血管外科（何仕誠、朱海東、方文、郭金和、鄧鋼）

何仕誠E-mail：shichenghe@vip.sina.com