延胡索醇提工藝的優(yōu)選

胡俊明蔣曉煌陳衛(wèi)紅* 余 輝

（1 湖南省平江縣大坪衛(wèi)生院，湖南 平江 414509；2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

延胡索醇提工藝的優(yōu)選

胡俊明1蔣曉煌2陳衛(wèi)紅3* 余 輝3

（1 湖南省平江縣大坪衛(wèi)生院，湖南 平江 414509；2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

目的 優(yōu)選延胡索的醇提最佳工藝。方法 以延胡索乙素含量和醇溶性浸出物為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選延胡索的提取工藝。結(jié)果 延胡索的最佳提取工藝為：粗粉，加75%乙醇提取2次，第1次加9倍量醇提取1.5 h，第2次加7倍量醇提取1.0 h。結(jié)論 優(yōu)選出的工藝簡(jiǎn)單可行，可用于延胡索的提取。

延胡索；正交設(shè)計(jì)；提取工藝；延胡索乙素；高效液相色譜法

延胡素為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥塊莖。具有活血，行氣，止痛。用于胸脅、脘腹疼痛，胸痹心痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，產(chǎn)后瘀阻，跌撲腫痛[1]。主要產(chǎn)于浙江和江蘇，其塊莖含延胡索甲素、乙素、丙素、丑素等，以及小蘗堿、去氫延胡索堿等多種生物堿[2-4]。延胡索甲素、乙素、丑素均有鎮(zhèn)痛作用，其中以左旋延胡索乙素（即顱痛定）的鎮(zhèn)痛作用較明顯[5-6]。本實(shí)驗(yàn)以延胡索乙素含量和醇溶性浸出物為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選其醇提工藝，為延胡索的提取工藝提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材 料

1.1儀器：1260型高效液相色譜儀（包括Diamonsil IC18色譜柱250× 4.6 mm，5 μm，Agilent LC/LCMS色譜工作站，美國(guó)安捷倫公司）；UV-2000型紫外分光光度計(jì)（日本島津）；EX224ZH型1/萬(wàn)電子天平（美國(guó)奧豪斯公司）；DK-S22電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（天津華鑫儀器廠）；FZ102型微型植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2試劑：延胡索乙素（供含量測(cè)定用，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110733-201309）；色譜純甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；批號(hào)21021106）；其他試劑均為分析純；水為高純水。

1.3藥材：延胡索購(gòu)于湖南三湘飲片有限公司，由湖南省藥品檢驗(yàn)所方石林主任藥師鑒定為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥塊莖。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件[1]：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-苯基液相色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH值至6.0）（55∶45）；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃。理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2對(duì)照品溶液的制備：精密稱取延胡索乙素對(duì)照品適量，加甲醇制成45 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備：將正交實(shí)驗(yàn)所定容至500 mL的提取液，過0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系的考察：精密吸取延胡索乙素對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μL依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以延胡索乙素質(zhì)量作為自變量X，峰面積作為因變量Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：y=1312.9 x-76.384，r=0.9996。結(jié)果延胡索乙素在0.09～0.9 μg之間線性關(guān)系良好。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其吸收峰面積，結(jié)果其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.95%，說明該儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密吸取供試品溶液10 μL于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定其吸收峰面積，RSD=1.24%。實(shí)驗(yàn)表明，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取已知含量（0.08%）的同一批延胡索粗粉約0.25 g 6份，精密稱定，其中兩份加入0.1 mg/mL的延胡索乙素對(duì)照品溶液2.0 mL，按《中國(guó)藥典》方法分別制備供試品溶液，再依法測(cè)定延胡索乙素的吸收峰面積，計(jì)算回收率，為98.32%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該含量測(cè)定方法回收率高，符合測(cè)定要求。

2.4.5樣品的含量測(cè)定：精密吸取正交設(shè)計(jì)9個(gè)樣品供試品溶液與對(duì)照品各10 μL，分別注入高效液相色譜儀中，同上述色譜條件測(cè)定延胡索乙素的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.5正交試驗(yàn)

2.5.1因素水平表經(jīng)預(yù)試實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道，影響延胡索醇提的因素主要有：藥物細(xì)度、乙醇濃度、加醇量與提取時(shí)間，故選擇L9（34）正交

表2　實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

表，探討以上四因素對(duì)延胡索提取的影響，其因素水平設(shè)定見表1。

表1　因素與水平

2.5.2表頭設(shè)計(jì)稱取延胡索粗粒（未切、未粉碎的亙貨）20 g 3份、粗粉（全部通過二號(hào)篩，但混有能通過四號(hào)篩不超過40%）20 g 3份、細(xì)粉（全部通過五號(hào)篩，并含能通過六號(hào)篩不少于95%）20 g 3份，分別按照表1的因素水平與表2的組合，加5倍量、7倍量或9倍量55%、75%、95%的乙醇提取1 h、1.5 h或2 h，濾過；再按括號(hào)內(nèi)的加醇量與提取時(shí)間提取第二次，濾過，合并濾液，定容至500 mL，搖勻，供測(cè)定延胡索乙素的含量；精密吸取醇提液50 mL，置已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸干，再置105 ℃烘箱干燥3 h，置玻璃干燥器中冷卻30 min，精密稱定重量，計(jì)算浸出百分含量，結(jié)果見表2。

2.5.3數(shù)據(jù)處理：按照文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行處理，其2個(gè)指標(biāo)相互獨(dú)立，且都是越大越好，故全概率積分等于2個(gè)指標(biāo)全概率評(píng)分之和，其全概率評(píng)分公式：與全概率積分公式：

P（Bi）=Xi延胡索乙素/∑Xi延胡索乙素+Xi浸出物/∑Xi浸出物

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3　方差分析表

由直觀分析結(jié)果可見，各因素對(duì)延胡索乙素提取率的影響效果順序?yàn)锳＞B＞C＞D，最佳組合為A2B2C3D1；方差分析結(jié)果表明，A、B二因素對(duì)延胡索乙素提取率具有顯著差異 （P＜0.05），C、D二因素對(duì)延胡索乙素提取率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合以上分析，最佳提取工藝為粗粉，加9倍量75%乙醇提取1.5 h，第二次加7倍量75%乙醇提取1 h。

2.5.4驗(yàn)證試驗(yàn)：取100 g延胡索三份，按照最佳工藝進(jìn)行放大驗(yàn)證，測(cè)定方法同上，結(jié)果延胡索乙素平均含量0.08%，浸出物15.9%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果2個(gè)指標(biāo)均比正交試驗(yàn)9個(gè)試驗(yàn)號(hào)中最大的還稍大，因此，優(yōu)選出的工藝條件可靠、合理、穩(wěn)定。

3　討 論

影響延胡索提取的主要條件為粉末粗細(xì)、乙醇濃度、提取時(shí)間、溫度。通過正交實(shí)驗(yàn)確定了延胡索的最佳提取工藝為：延胡索粗粉，加75%乙醇提取2次，第一次加9倍量提取1.5 h，第二次加7倍量提取1 h。

從理論上講，粉末越細(xì)，表面積越大，提取效率越高，但是，本實(shí)驗(yàn)細(xì)粉的提取率反而不如粗粉高，也許是細(xì)粉傳熱不好，易導(dǎo)致爆沸和燒鍋所致，再加之細(xì)粉在過濾時(shí)，藥粉吸附藥液較多，導(dǎo)致部分成分損失，故延胡索提取時(shí)，其粉末不宜太細(xì)，但是不切不粉碎的亙貨，提取效率更差。

延胡索的提取工藝報(bào)道較多，大多是考察醇濃度、加醇量、提取時(shí)間[8-9]與提取次數(shù)[10-12]，有用滲漉法提取的，以浸漬時(shí)間（A）、乙醇用量（B）、滲漉速度（C）為考察因素進(jìn)行工藝優(yōu)選[13]，有比較滲漉提取、回流提取與動(dòng)態(tài)逆流提取三種方法，認(rèn)為后者提取效率高，成本低[14]；有用超臨界CO2流體萃取法提取延胡索乙素的報(bào)道[15-16]。但是對(duì)其粉末細(xì)度作為考察因素未見，從擴(kuò)散公式可以看出，粉末細(xì)度對(duì)提取效率影響較大，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其粉末細(xì)度進(jìn)行考察，結(jié)果，對(duì)延胡索乙素含量與醇溶性浸出物具有顯著影響。

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Optimization ExtractionTechnology of Rhizoma Corydalis

HU Jun-ming1, JIANG Xiao-huang2, CHEN Wei-hong3, YU Hui3
(1 Dapingxiang Health Hospital of Pingjang, Pingjiang 414509, China; 2 Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 3 The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM， Changsha 410005， China）

Objective In order to select the best alcohol extraction of Rhizoma corydalis. Methods Taking the indexes of Tetrahydropalmatine and extract alcohol solublility, the ethanol extraction technology of Rhizoma corydalis were optimizated with orthogonal design test. Results The best extraction process were thick powder，with 75% ethanol extract twice， first 9 times the amount of ethanol extraction for 1.5 h， second 7 times ethanol extraction of 1.0 h. Conclusion The process is simple and feasible, Can be used for the extraction of rhizoma corydalis.

Rhizoma corydalis; Orthogonal design; Extract technics; Tetrahydropalmatine; HPLC

R282.710.3

B

1671-8194（2015）33-0004-02

湖南省科技廳資助項(xiàng)目（2013SK3104）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目