腦心通膠囊對(duì)慢性低灌注血管性癡呆小鼠神經(jīng)保護(hù)作用研究

馬亞珂等

[摘要] 目的 研究腦心通膠囊對(duì)慢性低灌注損傷所致的血管性癡呆小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法 取54只C57BL/6小鼠行雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄術(shù)建立慢性低灌注血管性癡呆模型，將造模成功的45只小鼠隨機(jī)分為模型組（n = 15）、Tempol組（n = 15）、腦心通組（n = 15）。另設(shè)假手術(shù)組（n = 10）。1 d后，Tempol組灌胃給予10 mg/mL Tempol溶液0.01 mL/（g·d），腦心通組灌胃給予腦心通350 mg/（kg·d），假手術(shù)組、模型組灌胃給予生理鹽水0.01 mL/（g·d），連續(xù)給藥28 d。采用Y迷宮檢測(cè)腦心通膠囊對(duì)血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響；利用蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦心通膠囊對(duì)海馬CA1區(qū)組織學(xué)變化及星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)情況。 結(jié)果 連續(xù)給藥28 d后，與模型組[（53.53±19.63）%]比較，Tempol組、腦心通組進(jìn)臂的自發(fā)交替百分比[（65.34±12.32）%、（65.19±4.85）%]明顯增加（P < 0.05）。HE染色顯示模型組C57BL/6小鼠的海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂、稀疏，細(xì)胞周圍間隙增大，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空腔。Tempol組、腦心通組的錐體細(xì)胞空腔減小，形態(tài)基本接近正常，細(xì)胞周圍間隙減小，接近正常形態(tài)。與假手術(shù)組[（27.01±6.18）個(gè)/mm2]比較，模型組海馬區(qū)每平方毫米活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目[（49.93±4.67）個(gè)/mm2]顯著增加（P < 0.05）；與模型組比較，Tempol組、腦心通組的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目[（38.71±11.67）、（40.68±8.57）個(gè)/mm2]明顯減少（P < 0.05），結(jié)構(gòu)明顯改善，分枝少，胞體形態(tài)趨于正常。 結(jié)論 腦心通膠囊可明顯提高慢性低灌注血管性癡呆小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，改善神經(jīng)組織形態(tài)，同時(shí)抑制激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，表明腦心通膠囊可以改善血管性癡呆C57BL/6小鼠腦組織的缺血性損傷。

[關(guān)鍵詞] 腦心通膠囊；血管性癡呆；低灌注；神經(jīng)保護(hù)作用；膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白

[中圖分類號(hào)] R749.13 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）10（a）-0004-05

Study on neuroprotective effect of Naoxintong Capsules on vascular dementia mice with chronic hypoperfusion

MA Yake1 YANG Yue1 ZHAO Buchang2 JIA Lifu2 ZHAO Jing2 WANG Hong1 YU Wenwen1 ZHANG Lusha1

1.Institute of Chinese Medicine， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine National Key Laboratory of Modern Chinese Medicine （Cutivation）， Tianjin 300193， China； 2.Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co. Ltd.， Shaanxi Province， Xi'an 712000， China

[Abstract] Objective To study the neuroprotective effect of Naoxintong Capsules on vascular dementia mice caused by chronic hypoperfusion damage. Methods Fifty four C57BL/6 mice were taken double carotid artery coarctation operation to establish vascular dementia mice model with chronic hypoperfusion. Forty five successful modeling mice were randomly divided into model group （n = 15）， Tempol group （n = 15） and Naoxintong group （n = 15）. Ten mice were set as sham group. One day later， Tempol group was given orally administration of 10 mg/mL Tempol solution 0.01 mL/（g·d）， Naoxintong group was given orally administration of Naoxintong 350 mg /（kg·d）， sham group and model group were given orally administration of normal saline 0.01 mL/（g·d）， continued for 28 d. Y maze was used to detect the learning and memory ability of Naoxintong Capsules for vascular dementia mice. The hematoxylin-eosin （HE） staining and immunohistochemistry were used to detect the histological change of Naoxintong Capsules for hippocampus CA1 region and the expression of Naoxintong Capsules for the marker glial filament acidic protein （GFAP） of astrocyte. Results After successive administration for 28 d， compared with model group [（53.53±19.63）%]， the spontaneous alternation percentages of entering arm in Tempol group and Naoxintong group [（65.34±12.32）%， （65.19±4.85）%] were increased significantly （P < 0.05）. HE staining showed that pyramidal cells of hippocampus CA1 region of C57BL/6 mice in model group were arranged in disorder and dispersely， the peripheral space was enlarged， there was cavity in cells. The cavity of pyramidal cells in Tempol group and Naoxintong group was reduced， the cell morphology was almost normal， the peripheral space was reduced and got close to normal. Compared with sham group[（27.01±6.18）/mm2]， the activated astrocyte number every square millimeter of model group [（49.93±4.67）/mm2] was increased significantly （P < 0.05）； compared with model group， the number of GFAP positive cells in Tempol group and Naoxintong group [（38.71±11.67）， （40.68±8.57）/mm2] was decreased significantly （P < 0.05）， the construction was improved significantly， the branch was reduced， and the cell morphology was tended to be normal. Conclusion Naoxintong Capsules can significantly enhance the space learning-memory ability of vascular dementia mice with chronic hypoperfusion， improve the morphology of nervous tissue， and inhibit activated astrocyte number at the same time， which shows that Naoxintong Capsules can improve the ischemic injury of brain tissue in C57BL/6 vascular dementia mice.

[Key words] Naoxintong Capsules； Vascular dementia； Hypoperfusion； Neuroprotective effect； Glial filament acidic protein

血管性癡呆（vascular dementia）是由各種腦血管疾病如缺血性卒中、出血性卒中等所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征，是一種慢性進(jìn)行性疾病[1]。造成血管性癡呆的原因，主要有缺血性腦損傷、腦血流減少、腦動(dòng)脈硬化及腦神經(jīng)細(xì)胞病變等[2-3]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)血管性癡呆的治療尚無(wú)確切的療法和藥物。腦心通膠囊是根據(jù)中醫(yī)理論在經(jīng)典方劑的基礎(chǔ)上加味而成的中藥復(fù)方制劑，由黃芪、丹參、當(dāng)歸、川芎、紅花、乳香、沒(méi)藥、桂枝、地龍及水蛭等16味中藥組成，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)等功效。臨床大量數(shù)據(jù)證實(shí)腦心通膠囊對(duì)心腦血管性疾病具有較好的治療效果[4]。雙側(cè)頸總動(dòng)脈微螺旋縮窄模型是新近出現(xiàn)的一種慢性低灌注缺血致血管性癡呆模型，更符合臨床血管性癡呆的病理特點(diǎn)（圖1）[5-6]，而國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)應(yīng)用該模型的報(bào)道。本研究采用該模型研究了腦心通膠囊對(duì)血管性癡呆的保護(hù)作用。

A為0.18 mm金屬微螺旋的形態(tài)及內(nèi)徑；B為慢性低灌注血管性癡呆模型（雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄術(shù)）的構(gòu)造圖；C為實(shí)際造模后C57BL/6小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈的縮窄狀態(tài)

圖1 小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈微螺旋縮窄模型

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)C57BL/6小鼠64只，10周齡，雄性，平均體重（20.00±5.00）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)溫度為22～25℃，相對(duì)濕度為40%～60%，每周更換墊料2次。

1.2 儀器與試劑

0.18 mm金屬螺旋環(huán)（Microcoil，SWPA/0.08×0.18×0.5×2.5，無(wú)錫薩密你彈簧有限公司中國(guó)）；大小鼠行為分析系統(tǒng)（Clever.Sys.Inc，美國(guó)）；Y迷宮（XR-XY1032上海欣軟信息科技有限公司，中國(guó)）；LEICA S8APO體視顯微鏡（型號(hào)DFC295，LEICA，德國(guó)）；LSM710顯微鏡（CarlZeiss LSM710，ZEISS，德國(guó)）。腦心通膠囊（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025001）；Tempol（214000-25G，SIGMA-ALDRICH，中國(guó)）；異氟烷（河北一品制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19980141）；GFAP試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，BA0056）；其他試劑為市售分析純。

1.3 方法

1.3.1 雙側(cè)頸總動(dòng)脈微螺旋縮窄模型及實(shí)驗(yàn)分組 54只C57BL/6小鼠行雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄術(shù)：三溴乙醇（0.33 mL/20 g）麻醉后，脫毛備皮并固定，置于體視顯微鏡下?？v向剪開(kāi)頸部皮層，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，將0.18 mm的金屬環(huán)套在頸總動(dòng)脈血管上（圖1），將浸有生理鹽水的紗布覆蓋頸部。0.5 h后將其右側(cè)頸總動(dòng)脈分離，將0.18 mm金屬環(huán)如前操作環(huán)套在右側(cè)頸總動(dòng)脈上。縫合頸部，蘇醒后放回籠中。監(jiān)測(cè)造模過(guò)程中慢性低灌注前后腦部血流變化。排除造模過(guò)程中出血死亡、術(shù)后未蘇醒及慢性低灌注后血流值未下降的小鼠，共納入45只小鼠。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組（n = 15）、Tempol組（n = 15）、腦心通組（n = 15）。另設(shè)假手術(shù)組（n = 10），假手術(shù)組除不做0.18 mm金屬環(huán)縮窄頸總動(dòng)脈外，其他操作如上。假手術(shù)組、模型組術(shù)后1 d灌胃給予生理鹽水0.01 mL/（g·d），Tempol組灌胃給予10 mg/mL Tempol溶液0.01 mL/（g·d），腦心通組灌胃給予350 mg/（kg·d）腦心通膠囊，連續(xù)給藥28 d。

1.3.2 Y迷宮 術(shù)后28 d后進(jìn)行Y迷宮實(shí)驗(yàn)。由A臂放入，在3個(gè)臂中自由活動(dòng)480 s，記錄480 s內(nèi)小鼠在A、B、C三個(gè)臂的穿梭次數(shù)。按A、B、C三個(gè)臂選擇性穿梭的次數(shù)（即每次經(jīng)過(guò)中心象限后均進(jìn)入不同于上一次進(jìn)入的象限，如ABC或CAB或ACB，而不是BAB或ACA）與總穿梭次數(shù)的比值，比值越大，說(shuō)明小鼠的空間記憶能力越好[7]。

1.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色 連續(xù)給藥28 d后，磷酸鹽緩沖液（PBS）和4%多聚甲醛各25 mL心臟灌流。取出腦組織后4%多聚甲醛固定。24 h后放入自動(dòng)脫水機(jī)中進(jìn)行脫水，石蠟包埋切片，選擇海馬部位的切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，于光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞激活 按照膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（GFAP）試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行SABC免疫組化染色（一抗稀釋比為1∶100；二抗是即用型抗體），具體操作如下：①石蠟切片常規(guī)脫蠟經(jīng)乙醇脫水，PBS（pH 7.4）沖洗5 min×3次；②3% H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水洗3次，PBS浸泡5 min；③置入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 6.0）的容器中，放入數(shù)控抗原熱修復(fù)儀中加熱至溫度達(dá)到120℃，保持15 min，然后排氣降溫，取出切片，自然冷卻至室溫，PBS沖洗5 min×3次；④加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，37℃封閉30 min；⑤傾去多余的封閉液，滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗于切片上，4℃過(guò)夜；⑥PBS沖洗5 min×3次，除去PBS液，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次；⑦滴加即用型SABC溶液，37℃孵育20 min，PBS沖洗5 min×3次；⑧DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察染色強(qiáng)度，以控制反應(yīng)時(shí)間，通常5～10 min，滴加蒸餾水終止反應(yīng)；⑨蘇木精復(fù)染2 min，蒸餾水沖洗10 min，鹽酸酒精分化5 s，蒸餾水沖洗10 min；⑩梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。對(duì)照：用0.01 mol/L PBS代替一抗做陰性對(duì)照。拍照，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況。定量分析計(jì)數(shù)方法：于海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞層，在40×10倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算每平方毫米內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Y迷宮實(shí)驗(yàn)

自發(fā)交替百分比越大，表明動(dòng)物空間記憶的能力越強(qiáng)。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠慢性低灌注后空間記憶能力顯著降低（P < 0.05）。與模型組比較，Tempol組、腦心通組進(jìn)臂的自發(fā)交替百分比顯著增加（P < 0.05）。各組別之間的Y迷宮總進(jìn)臂次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），表明各組小鼠常規(guī)的移動(dòng)未受到雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄和口服腦心通的影響。見(jiàn)表1。

表1 腦心通膠囊對(duì)慢性低灌注血管性癡呆小鼠空間記憶能力的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

2.2 HE染色

假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞呈多層排列，且整齊緊密，結(jié)構(gòu)清晰，分布均勻，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目多，外形規(guī)則，細(xì)胞層3～5層，細(xì)胞圓形或橢圓形，染色較淡，染色質(zhì)均勻，核膜邊界清晰，核仁圓且明顯，呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色；模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂、稀疏，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少，可見(jiàn)嗜酸性神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象，細(xì)胞核體積變小，深染，呈固縮狀或僅呈現(xiàn)很淡的藍(lán)色甚至藍(lán)色消失，細(xì)胞周圍間隙增大，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空腔，細(xì)胞間質(zhì)成分顆粒狀分布明顯；與模型組比較，Tempol組、腦心通組神經(jīng)細(xì)胞外形基本規(guī)則，細(xì)胞周圍間隙較模型組小，細(xì)胞空腔現(xiàn)象比模型組輕，細(xì)胞間質(zhì)成分呈顯微排列，接近正常。見(jiàn)圖2（封三）。

2.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞激活

活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GFAP陽(yáng)性染色后呈棕黃色，周圍有放射狀突起，呈分支狀，形態(tài)如蜘蛛樣。陰性對(duì)照切片未見(jiàn)GFAP免疫反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果見(jiàn)表2、圖3（封三）。假手術(shù)組C57BL/6小鼠的海馬區(qū)僅見(jiàn)少量GFAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，染色淺，突起細(xì)、短（圖3箭頭所示）；與假手術(shù)組比較，模型組C57BL/6小鼠的海馬CA1區(qū)GFAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P < 0.05），細(xì)胞深染，突起變長(zhǎng)、增粗和分支增多；與模型組比較，Tempol組、腦心通組海馬CA1區(qū)GFAP染色數(shù)目減少（均P < 0.05），染色較淺，結(jié)構(gòu)明顯改善，分枝少，胞體形態(tài)趨于正常。

表2 腦心通膠囊對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響（x±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；GFAP：膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白

3 討論

血管性癡呆嚴(yán)重影響著中老年人的健康，是亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。慢性腦供血不足是血管性癡呆重要的誘發(fā)因素。從病理學(xué)上來(lái)說(shuō)，腦白質(zhì)損傷后海馬區(qū)發(fā)生反應(yīng)性的神經(jīng)膠質(zhì)增生并發(fā)玻璃樣變或纖維化及腦部血管壁增厚的動(dòng)脈硬化性病變等，此類病變可導(dǎo)致腦組織多區(qū)域的功能損傷[8]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于慢性低灌注模型的構(gòu)造多為結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈[9-12]，對(duì)模擬臨床患者的實(shí)際情況有一定局限。本研究采用小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈微螺旋縮窄模型探討腦心通膠囊治療血管性癡呆的藥理作用，該模型對(duì)腦部進(jìn)行慢性低灌注，腦部組織膠質(zhì)細(xì)胞激活和白質(zhì)損傷明顯，更符合臨床實(shí)際。

腦心通膠囊是在補(bǔ)陽(yáng)還五湯的基礎(chǔ)上增加蟲(chóng)類藥和活血化瘀藥而成的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，在臨床上廣泛用于治療心腦血管性疾病[13]。相關(guān)文獻(xiàn)提示腦心通膠囊可以通過(guò)抑制與炎癥細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能缺損，減輕缺血再灌注對(duì)大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，降低腦水腫程度，提高小鼠空間記憶能力[14-15]。本研究結(jié)果提示，腦心通可以改善慢性低灌注血管性癡呆模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及組織學(xué)病理形態(tài)。

本研究中采用Tempol作為陽(yáng)性藥，是一種新型自由基清除劑。文獻(xiàn)[16-17]提示Tempol可清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷；Tempol預(yù)處理可以改變腦組織的氧化環(huán)境，對(duì)缺血缺氧損傷的腦組織神經(jīng)功能的恢復(fù)具有保護(hù)作用[16-20]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)為數(shù)最多、功能復(fù)雜的一類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元的存活、腦組織損傷的修復(fù)有重要作用[21-25]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織受損時(shí)明顯增加，早期的腦損傷應(yīng)激性增加的星形膠質(zhì)細(xì)胞可參與腦組織內(nèi)相關(guān)修復(fù)作用，但過(guò)度增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌相關(guān)抑制因子，參與瘢痕形成，影響神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)和突觸的構(gòu)建，也可產(chǎn)生細(xì)胞炎性因子等，引發(fā)炎性反應(yīng)，加快腦組織損傷[26-28]。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞合成的重要骨架蛋白，GFAP表達(dá)程度可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍程度。本研究發(fā)現(xiàn)腦心通膠囊可以抑制慢性低灌注損傷模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，這可能是其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一。

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（收稿日期：2015-05-27 本文編輯：張瑜杰）