山楂與苞葉雪蓮水提物對(duì)小鼠防輻射作用的研究

劉 穎 張勤勇 何興坤 劉 瑜

（云南省腫瘤醫(yī)院藥劑科，云南 昆明 650118）

山楂與苞葉雪蓮水提物對(duì)小鼠防輻射作用的研究

劉 穎 張勤勇 何興坤 劉 瑜

（云南省腫瘤醫(yī)院藥劑科，云南 昆明 650118）

目的 研究山楂和苞葉雪蓮水提物對(duì)小鼠的防輻射作用。方法 選擇40只小鼠作為研究對(duì)象，隨機(jī)分配到空白組、造模組、山楂組、苞葉雪蓮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，造模組、山楂組、苞葉雪蓮分別給以相同劑量的0.9%生理鹽水、山楂水提物和苞葉雪蓮水提物，灌胃14 d后接受4 Gy的X線一次性全身照射，24 h后處死小鼠，測(cè)量小鼠骨髓細(xì)胞微核率。結(jié)果 山楂組和苞葉雪蓮組微核率均低于造模組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。結(jié)論 山楂及苞葉雪蓮水提物中的活性成分對(duì)小鼠有一定程度的防輻射損傷作用。

山楂；苞葉雪蓮；防輻射損傷；微核試驗(yàn)

山楂（Crataegus）為薔薇科山楂屬植物，落葉喬木，全球大約有250種［1］。我國(guó)約有16種，其中山里紅山楂和野山楂最為常見(jiàn)。山楂味酸、微甜，性溫和，具有消食化積、活血化瘀之功效，臨床上常用于消化不良及產(chǎn)后腹痛等癥［2］。山楂含有酚類和黃酮類化合物，包括綠原酸、表兒茶酸、蕓香苷、金絲桃苷和牡荊素，有研究表明這些化合物的作用方式可能是抗氧化和清除自由基活性的來(lái)源，對(duì)人胚肺2BS細(xì)胞和誘癌細(xì)胞等具有一定抑制作用［3］；對(duì)環(huán)磷酰胺至小鼠精子畸變也具有一定的抑制作用，可能與山楂中含有的大量亞油酸及VC等成分有關(guān)［4］。

苞葉雪蓮（Saussurea obvallata）為菊科植物鳳毛菊屬，多年生草本植物。一般生長(zhǎng)甘肅、青海、四川、云南、西藏以及南亞喜馬拉雅山地區(qū)，海拔3500米以上的高山流石灘上，是一種典型的高山植物。其化學(xué)成分中包含生物堿、黃酮類、內(nèi)酯、甾醇、多糖及揮發(fā)油等多種成分，其主要次生代謝產(chǎn)物是黃酮及黃酮苷類化合物［5］，這些成分對(duì)人體具有重要的藥用價(jià)值。近年，國(guó)內(nèi)外研究資料表明雪蓮提取物有抗輻射損傷作用，其機(jī)制可能與清除羥自由基、防止染色體畸變、提高免疫功能等有關(guān)［6］。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠分別進(jìn)行山楂和苞葉雪蓮提取物灌胃，然后對(duì)其輻射，測(cè)量小鼠骨髓細(xì)胞微核率，以探討山楂和苞葉雪蓮提取物在防輻射損傷中的效果。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種雌雄各半小鼠40只，健康SPF級(jí)，6～8周齡，體質(zhì)量為（18±2）g，飼養(yǎng)溫度22～27 ℃，12 h光照，12 h黑暗。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物：山楂和苞葉雪蓮均由云南省中醫(yī)中藥研究所提供，水體液濃度0.3 g/mL，在云南大學(xué)天然藥物教研室制成，2～4 ℃冰箱保存待用。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：小鼠隨機(jī)分成4組，即：空白組、造模組、山楂組、苞葉雪蓮組，各10只，以苦味酸標(biāo)記區(qū)分，置于清潔干燥的籠中飼養(yǎng)。

1.4藥物配置及給藥方式：用0.9%生理鹽水將實(shí)驗(yàn)藥物配置成0.3 g/mL的溶液，2～4 ℃冰箱保存，根據(jù)小鼠重量，按0.2 mL/10 g計(jì)算給藥量，使用鈍針頭進(jìn)行灌胃給藥。其中，空白組和造模組均用0.9%生理鹽水進(jìn)行灌胃，山楂組以0.16 g/（kg·d）山楂水提物灌胃，苞葉雪蓮組以0.16 g/（kg·d）苞葉雪蓮水體物灌胃，連續(xù)給予灌胃14 d。

1.5照射方式：在藥物灌胃的第15天，對(duì)除空白組以外的其余小鼠進(jìn)行一次性直線加速器X線全身照射，照射野為25 cm×25 cm，源皮距SSD100 cm，劑量為4 Gy（亞致死劑量），劑量率為400 mU/min，分別給予造模組、山楂組和苞葉雪蓮組的小鼠進(jìn)行照射。

1.6指標(biāo)測(cè)定及方法：照射后24 h頸椎脫臼處死小鼠，檢測(cè)小鼠微核試驗(yàn)。小鼠骨髓細(xì)胞微核檢測(cè)采用Schmid描述的方法。兩根股骨的骨髓均沖洗滴進(jìn)進(jìn)裝進(jìn)裝有胎牛血清（FCS）的離心管中。用滴管將細(xì)胞輕輕吹開(kāi)，然后離心機(jī)4 ℃下400 g離心5 min。將離心出的細(xì)胞重新滴在一滴胎牛血清中，骨髓細(xì)胞玻片就準(zhǔn)備好了，推片要避免明顯的偏移。24 h空氣干燥后，涂片用May-Grunwald/Giemsa染液染色。用這個(gè)方法，嗜多染紅細(xì)胞被染成紅藍(lán)色，正染紅細(xì)胞被染成橘黃色，核物質(zhì)被染成黑紫色。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)10只小鼠共計(jì)數(shù)10000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，來(lái)計(jì)算小鼠微核情況。

1.7觀片：觀察記錄1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE）中含微核的數(shù)；另外觀察200個(gè)PCE，同時(shí)記錄正染紅細(xì)胞個(gè)數(shù)，求PCE/NCE值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法為t檢驗(yàn)和方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2　結(jié) 果

表1　小鼠骨髓PCE微核率和PCE/NCE值情況

與空白組比較，造模組、山楂組、苞葉雪蓮組微核率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01提示造模成功。山楂組小鼠微核率低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01；苞葉雪蓮組小鼠微核率低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。從微核率數(shù)值上看，山楂組微核率低于苞葉雪蓮組，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。見(jiàn)表1和圖1。

圖1　各組微核率的比較示意圖

3　討 論

自由基導(dǎo)致的機(jī)體細(xì)胞氧化損傷與很多疾病的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切［7-8］，許多的天然產(chǎn)物中含有抗氧化成分，尋找安全和有效的天然抗氧化劑成為目前研究的一大熱點(diǎn)。電離輻射對(duì)人體的損傷是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，主要引起人體內(nèi)大分子物質(zhì)的激發(fā)和電離，在此基礎(chǔ)上，引起細(xì)胞代謝功能紊亂和細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)的破壞，從而產(chǎn)生細(xì)胞水平的損傷效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致組織器官病變。致電離輻射穿過(guò)活的組織產(chǎn)生自由基，自由基和DNA的相互作用導(dǎo)致DNA的損傷從而導(dǎo)致突變和癌的發(fā)生。保護(hù)人們免受電離輻射的損傷非常重要，阿米福汀等硫醇基化合物是早期被研究的放射防護(hù)劑，雖然其放射防護(hù)效果顯著，但不良反應(yīng)大和毒性強(qiáng)，臨床應(yīng)用受到限制。目前國(guó)內(nèi)外的一些研究表明，一些植物產(chǎn)品具有較好的保護(hù)生物體免受電離輻射作用，且很少有不良反應(yīng)，如段偉等［7］通過(guò)多次動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苞葉雪蓮、山楂、三七、小紅參、茜草等天然中草藥具有防輻射作用［9］。

放射線可以引起DNA損傷，導(dǎo)致微核出現(xiàn)，將小鼠在靜磁場(chǎng)中暴露，微核率顯著增加，且隨著放射劑量的增加微核率也隨之增加。有研究表明微核數(shù)增加可歸因于靜磁場(chǎng)引起的應(yīng)急反應(yīng)或者靜磁場(chǎng)造成的直接斷裂和紡錘體干擾效應(yīng)［10］。微核（Micronucleus，簡(jiǎn)稱MCN），也叫衛(wèi)星核，是真核類生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，是染色體畸變?cè)陂g期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。普遍認(rèn)為，微核是在有絲分裂后期由喪失著絲粒的染色體片斷產(chǎn)生的，細(xì)胞分裂時(shí)，受到某種有害理化因子損傷，染色體發(fā)生斷裂，在下一次分裂后期，喪失著絲粒的染色體片斷不能進(jìn)入子細(xì)胞的主核，形成核外的微小染色質(zhì)塊，即微核。有研究者認(rèn)為微核可能是細(xì)胞凋亡的產(chǎn)物，當(dāng)致畸因素激活凋亡基因，引起內(nèi)切酶激活后切割DNA ，而形成細(xì)胞核碎片，最終產(chǎn)生微核［11］。

X-射線照射后引起DNA損傷的增加在不同的研究中都觀察到過(guò)。在當(dāng)前研究中，經(jīng)X-射線照射后，無(wú)論模型組和用藥組微核的發(fā)生率均提高，其中山楂組、苞葉雪蓮組小鼠微核率均低于模型組，說(shuō)明山楂和苞葉雪蓮等具有抗氧化作用的植物藥可以保護(hù)生物組織對(duì)抗氧化應(yīng)激。山楂提取物中含有大量的酚類化合物，這些酚類化合物（綠原酸，金絲桃苷，表兒茶酸）的抗氧化活性可能是山楂生物學(xué)活性的主要機(jī)制。綠原酸以劑量依賴方式直接清除羥自由基，清除過(guò)氧化氫引起的活性氧，在神經(jīng)細(xì)胞系，綠原酸對(duì)氧化應(yīng)激有防護(hù)作用［12］。陳發(fā)菊等［13］研究提示苞葉雪蓮的化學(xué)成分主要含生物堿、黃酮類、多糖、內(nèi)酯甾醇和揮發(fā)油等成分，主要的次生代謝產(chǎn)物是黃酮及黃酮苷類等。Valentov等［14］的實(shí)驗(yàn)表明雪蓮果葉的提取物中的原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素等成分有抗氧化作用，尤其以槲皮素為代表的黃酮類物質(zhì)抗氧化作用最強(qiáng)，能有效的抑制脂質(zhì)氧化，能幫助生物體起到很好的對(duì)抗氧化應(yīng)激作用。本研究的結(jié)果進(jìn)一步論證了山楂及苞葉雪蓮提取物具有防X射線損傷的作用。

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Investigation of Radioprotective Effects of Aqueous Extract of Crataegus and Saussurea Obvallata on Mice

LIU Ying， ZHANG Qin-yong， HE Xing-kun， LIU Yu
（Department of Pharmacy， Yunnan Cancer Hospital， Kunming 650118， China）

Objective To preliminarily explore the radioprotective effects of the aqueous extract of Crataegusand Saussurea obvallata on the mice from radiation injury. Methods After mice were irradiated with 4 Gy of X-ray， administered at same doses of aqueous extract of Crataegusand Saussurea obvallata for 14 days. 1 days after irradiation， mice were sacrificed and measured micronucleus rate. Results Each treatment group with irradiation group compared with the irradiated group， Crataegus dose and Saussurea obvallata dose mice micronucleu rate was lower than the model group， which in the dose group and Crataegus dose group was significantly lower than the model group， there was significant difference， P＜0.01. Conclusions The natural herb Crataegusand Saussurea obvallata active ingredient have some degree of radioprotective effects in mice， which Crataegus dose group was significantly more than Saussurea obvallata dose.

Crataegus； Saussurea obvallata； Radiation damage； Micronucleus test

R-33

B

1671-8194（2015）29-0022-02