纖維堆囊菌SoF5-76產(chǎn)埃博霉素B分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

馬利云 龔國(guó)利 王娜

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021）

纖維堆囊菌SoF5-76產(chǎn)埃博霉素B分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

馬利云 龔國(guó)利 王娜

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021）

埃博霉素發(fā)酵生產(chǎn)體系復(fù)雜，且生產(chǎn)菌株較難操作，導(dǎo)致發(fā)酵參數(shù)測(cè)定困難，迄今為止未見(jiàn)關(guān)于埃博霉素發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方面的報(bào)道。利用5 L發(fā)酵罐，對(duì)纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）產(chǎn)埃博霉素B（Epothilone B）的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中維持溫度30℃、pH7.4。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌體干重達(dá)3.00 g/L，埃博霉素B產(chǎn)量達(dá)18.20 mg/L，葡萄糖含量為0.049 g/L?；贚ogistic方程和Luedking-Piret方程，利用MATLAB軟件對(duì)其進(jìn)行非線性擬合，構(gòu)建了菌體生長(zhǎng)、埃博霉素B合成和葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型。結(jié)果表明，該組模型能較好的擬合發(fā)酵過(guò)程。

纖維堆囊菌；埃博霉素B；分批發(fā)酵；動(dòng)力學(xué)模型；MATLAB；非線性擬合

埃博霉素（Epothilones）是微生物粘細(xì)菌產(chǎn)生的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］，其殺死腫瘤機(jī)制與紫杉醇相似，能夠在癌癥晚期抑制紡錘體和紡錘絲的形成，從而抑制有絲分裂，阻止癌細(xì)胞增殖，具有廣譜的抗癌療效。埃博霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行修飾，來(lái)源不受限制，可以通過(guò)大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵進(jìn)行制備等，其有望成為繼紫杉醇之后更為有效的抗腫瘤藥物，具有廣闊的市場(chǎng)前景，因此受到學(xué)術(shù)界和企業(yè)界的密切關(guān)注。目前已有一個(gè)埃博霉素藥物（BMS-247550，Ixabepilone）用于卵巢癌的治療，且注射劑已上市，另外其它埃博霉素藥物（ABJ-879，Patupilone、BMS-310705、KOS-862、KOS-1584和ZK-EPO等）正在進(jìn)行臨床研究［2，3］，但埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量較低及成本較高，極大地限制了該類抗腫瘤藥的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，因此如何提高生產(chǎn)菌株的產(chǎn)埃博霉素能力仍是目前該藥物研發(fā)的一大熱點(diǎn)。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究菌體生長(zhǎng)速率、基質(zhì)消耗速率、產(chǎn)物生成速率的相互關(guān)系，并用一定形式的數(shù)學(xué)模型將發(fā)酵過(guò)程中的有關(guān)因素進(jìn)行定量描述，對(duì)進(jìn)一步確定發(fā)酵過(guò)程中最佳發(fā)酵工藝條件和設(shè)計(jì)合理的發(fā)酵過(guò)程有極大幫助［4］。由于埃博霉素發(fā)酵生產(chǎn)體系復(fù)雜且難以控制，發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究比較困難。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)埃博霉素發(fā)酵生產(chǎn)的研究報(bào)道大都是基于搖瓶試驗(yàn)的結(jié)果［5-10］，只有少量文獻(xiàn)在發(fā)酵罐水平進(jìn)行描述［11，12］，未見(jiàn)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究報(bào)告。本試驗(yàn)是基于實(shí)驗(yàn)室所保藏的纖維堆囊菌以葡萄糖為底物，進(jìn)行5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B的動(dòng)力學(xué)研究，分別建立菌體生長(zhǎng)、底物消耗、產(chǎn)物生成的動(dòng)力學(xué)模型，采用MATLAB軟件對(duì)其進(jìn)行非線性擬合，旨在得到相對(duì)應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)估計(jì)值，為后續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究奠定良好基礎(chǔ)，對(duì)利用中小試數(shù)據(jù)進(jìn)行大型發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實(shí)驗(yàn)室所保存的菌纖維堆囊菌SoF5-76（Sorangium cellulosum SoF5-76）。來(lái)源：由本實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選，經(jīng)基因組重組技術(shù)選育獲得，埃博霉素B搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為35.24 mg/L［5-7］。

1.1.2 培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯淀粉3.9，脫脂奶粉2.2，豆餅粉1.5，MgSO4·7H2O 2.5，CaCl21.3，葡萄糖1，EDTA-Fe3+3 mL/L，微量元素液0.5 mL/L，pH7.4，115℃滅菌30 min。

M26種子培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯淀粉8，豆蛋白胨2，葡萄糖2，酵母粉2，MgSO41，CaCl21，EDTA-Fe3+1 mL/L，pH7.2，115℃滅菌30 min。

斜面保藏培養(yǎng)基（g/L）：KNO30.5，Na2HPO40.25，MgSO4·7H2O 1，EDTA-Fe3+1 mL/L，微量元素液 1 mL/L，瓊脂2%，pH7.2，121℃滅菌30 min。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 BIOF-6000B發(fā)酵罐：上海高機(jī)生物工程有限公司制造；Waters-2487-2420-1535高效液相色譜儀，美國(guó)waters公司；Hitachi himac CR21G高速冷凍離心機(jī)（日本，日立）。大孔吸附樹(shù)脂XAD-16，Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 種子培養(yǎng) 將保藏的纖維堆囊菌SoF5-76接入放有已滅菌濾紙片的CNST平板上，30℃恒溫培養(yǎng)5-7 d，之后按一定的接種量轉(zhuǎn)接到M26培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/250 mL，恒溫?fù)u床（170 r/min），30℃培養(yǎng)72 h，獲得發(fā)酵種子液。

1.2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng) 以8%（V/V）接種量將所得種子液接種到5 L發(fā)酵罐中，裝液量為60%。發(fā)酵條件為：溫度30℃、pH7.4、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、通氣量1.0 vvm，罐壓控制在0.01 MPa。培養(yǎng)7 d，每隔1 d取樣，分別測(cè)定菌體干重、還原糖濃度和埃博霉素B產(chǎn)量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 發(fā)酵過(guò)程中參數(shù)的測(cè)定 生物量的測(cè)定：采用菌體干重法［13］。還原糖的測(cè)定：用 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［14］。

埃博霉素B提取及含量測(cè)定：將獲得的樣品進(jìn)行離心，收集樹(shù)脂，經(jīng)10倍體積甲醇浸提、濃縮后，采用HPLC對(duì)其含量進(jìn)行定量分析。高效液相色譜條件［15］：C18色譜柱（YWG，10 μm，250×4.6 mm），柱溫30℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為249 nm；流動(dòng)相為甲醇∶水（含0.2%乙酸）=65∶35；上樣體積為20 μL；時(shí)間為30 min；流速為1 mL/min。埃博霉素B的定量采用本實(shí)驗(yàn)室通用標(biāo)準(zhǔn)曲線。方程為：y=0.132x+0.0035（y：埃博霉素B的產(chǎn)量（mg/L），x：峰面積）。利用HPLC檢測(cè)埃博霉素B得到峰面積，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出埃博霉素B的產(chǎn)量。

1.2.2.2 數(shù)據(jù)的處理 利用MATLAB軟件對(duì)實(shí)際測(cè)得的纖維堆囊菌SoF5-76分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，求得模型相關(guān)參數(shù)，建立動(dòng)力學(xué)模型。再通過(guò)Origin8.0軟件將所得模型定義為擬合函數(shù)，采用的算法是修正的高斯-牛頓法（Levenberg-Marquardt），以誤差平方和最小為目標(biāo)，可以獲得模型參數(shù)初估值，然后要不斷對(duì)其進(jìn)行修正直到獲得最優(yōu)值。

2 結(jié)果

2.1 埃博霉素B發(fā)酵過(guò)程的代謝變化

圖1顯示，0-2 d菌體干重有所增加，但增長(zhǎng)緩慢，可能是種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，需要適應(yīng)新的環(huán)境，需經(jīng)歷短暫的遲滯期。3-4 d菌體干重迅速增長(zhǎng)，菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。第5天菌體干重基本維持不變，進(jìn)入穩(wěn)定期。埃博霉素B的大量產(chǎn)生主要集中在發(fā)酵第4-5天。其產(chǎn)量高峰出現(xiàn)和結(jié)束比細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的時(shí)間分別推遲1 d。

分析還原糖的變化曲線可知，0-2 d還原糖濃度略有降低，發(fā)酵前期與菌體生長(zhǎng)相適應(yīng)，第2天開(kāi)始還原糖消耗明顯加快，第3-4天進(jìn)入快速耗糖期，從第5天至發(fā)酵結(jié)束還原糖濃度降低緩慢；從埃博霉素B生成曲線得知，其生成與還原糖消耗基本相對(duì)應(yīng)。0-2 d只產(chǎn)生極少的埃博霉素B，第2天后產(chǎn)生速度有所加快，從第3天開(kāi)始到第5天進(jìn)入埃博霉素B快速產(chǎn)生期，第5天后埃博霉素B的產(chǎn)生速度開(kāi)始減慢，直到發(fā)酵結(jié)束埃博霉素B產(chǎn)量維持不變；通過(guò)分析菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的變化曲線，埃博霉素B進(jìn)入快速產(chǎn)生期滯后于菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，當(dāng)菌體處于穩(wěn)定期時(shí)，埃博霉素B產(chǎn)量仍處于快速生產(chǎn)期。因此得出：纖維堆囊菌SoF5-76產(chǎn)埃博霉素B發(fā)酵屬于產(chǎn)物形與菌體生長(zhǎng)部分偶聯(lián)。

圖1 發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程曲線

2.2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立及求解

2.2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 微生物菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型采用Logistic［16］方程：

其中，μm為最大比生長(zhǎng)速率（h-1）；Xm為菌體生長(zhǎng)上限（g/L），X為菌體濃度（g/L）。

Logistic模型是微生物發(fā)酵過(guò)程中普遍存在的一個(gè)典型S型曲線，能很好地反映分批發(fā)酵過(guò)程中因菌體濃度的增加對(duì)自身生長(zhǎng)存在的抑制作用［16-17］。發(fā)酵初始，菌體濃度很低，菌體濃度（X）遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到菌體生長(zhǎng)上限（Xm），因此X/Xm項(xiàng)可忽略，此時(shí)模型表示菌體呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；菌體在對(duì)數(shù)期結(jié)束后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，此時(shí)菌體濃度（X）近似于最大菌體濃度（Xm），表示菌體生長(zhǎng)停止。

在初始條件t=0時(shí)，有X=X0，對(duì)式（1）求微分方程，得：

利用MATLAB軟件對(duì)實(shí)際測(cè)得的纖維堆囊菌SoF5-76菌體干重?cái)?shù)值進(jìn)行擬合并通過(guò)參數(shù)修正，求解得出：X0=0.051 g/L；μm=1.547 h-1；Xm=2.945 g/L。分別將X0、μm和Xm的值代入（2）式，得到菌株SoF5-76生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為：

將試驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)與式（3）的擬合曲線相比較，結(jié)果（圖2）顯示，該菌體的生長(zhǎng)擬合模型與實(shí)測(cè)值擬合情況比較理想，能較好地反應(yīng)菌體SoF5-76的生長(zhǎng)情況，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，模型的F檢驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)R2=0.997，說(shuō)明該模型可以解釋99.7%試驗(yàn)所得菌體干重的變化，表明模型擬合良好，試驗(yàn)結(jié)果和預(yù)測(cè)值之間具有較好的一致性。這說(shuō)明該方程可作為菌株SoF5-76的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型。

圖2 細(xì)胞生長(zhǎng)的擬合曲線與實(shí)驗(yàn)測(cè)得值比較圖

2.2.2 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型 根據(jù)分批發(fā)酵產(chǎn)物生成和菌體細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，Garden將產(chǎn)物形成分成3類：產(chǎn)物生成與生長(zhǎng)相關(guān)、部分相關(guān)和不相關(guān)。因此，將產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型分為3種類型［18］：（I）生長(zhǎng)相耦聯(lián)型，只有在菌體生長(zhǎng)的情況下才有產(chǎn)物形成；（II）部分耦聯(lián)型，菌體生長(zhǎng)時(shí)有一些產(chǎn)物生成，部分或大部分產(chǎn)物是在穩(wěn)定期形成的，此階段菌體生長(zhǎng)處于停止期；（III）非生長(zhǎng)偶聯(lián)型，產(chǎn)物形成與菌體是否生長(zhǎng)沒(méi)有關(guān)系。根據(jù)上述纖維堆囊菌SoF5-76發(fā)酵過(guò)程曲線推斷出菌株SoF5-76為部分偶聯(lián)型，Luedeking-Piret方程可以對(duì)其產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行描述：

其中，α是與菌體生長(zhǎng)有關(guān)的產(chǎn)物形成比例常數(shù)，β為與菌體濃度有關(guān)的產(chǎn)物形成比例系數(shù)（h-1）；αdx/dt表示與菌體生長(zhǎng)率相關(guān)的產(chǎn)物形成率；βx是與非伴隨菌體生長(zhǎng)的產(chǎn)物形成率，p為產(chǎn)物濃度（g/L）。

將式（1）代入式（4）得：

在初始條件t=0時(shí)，埃博霉素B濃度P=0。對(duì)式（5）積分得：

其中，P為產(chǎn)物埃博霉素B濃度（g/L）；μm為最大比生長(zhǎng)速率（h-1）；X0為菌體初始濃度（g/L）；Xm為菌體生長(zhǎng)上限（g/L）；α和β為常數(shù)。

利用MATLAB軟件對(duì)實(shí)際測(cè)得的產(chǎn)物埃博霉素B產(chǎn)量數(shù)值進(jìn)行擬合并通過(guò)參數(shù)修正，求得α=3.232，β=0.803；分別將α、β、X0、μm和 Xm的值代入模型方程，經(jīng)整理得到埃博霉素B生成動(dòng)力學(xué)模型為：

將式（7）的埃博霉素B生成擬合曲線與實(shí)驗(yàn)測(cè)得值相比較，結(jié)果（圖3）顯示，該產(chǎn)物擬合模型與實(shí)測(cè)值擬合情況比較理想，能夠較好地反應(yīng)埃博霉素B的生成情況。在95%的置信區(qū)間內(nèi)，模型經(jīng)F檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)為R2=0.964，即模型在96.4%的概率水平上是非常顯著的。這說(shuō)明該方程可作為SoF5-76的埃博霉素B的生成動(dòng)力學(xué)模型公式。

圖3 埃博霉素B生成擬合曲線與實(shí)驗(yàn)測(cè)得值的比較

2.2.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型 在發(fā)酵過(guò)程中，底物消耗主要有3個(gè)方面：細(xì)胞生長(zhǎng)的消耗，合成新的細(xì)胞；細(xì)胞維持基本生命活動(dòng)的消耗；合成代謝產(chǎn)物的消耗。因此底物消耗動(dòng)力學(xué)可用如下模型描述：

式中，yx/s是碳源用于菌體生長(zhǎng)的得率常數(shù)；yp/s是碳源用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)；mx是微生物碳源的維持常數(shù)，s為底物濃度（g/L）。

用于產(chǎn)生能量供細(xì)胞維持生命活動(dòng)所消耗的底物很少，為建模簡(jiǎn)化起見(jiàn)，可以將其忽略。埃博霉素B分批發(fā)酵過(guò)程中底物的消耗就分為細(xì)胞生長(zhǎng)和埃博霉素B生成兩部分。因此底物消耗動(dòng)力學(xué)模型用（9）式表述：

將式（4）代入式（8），整理后得

在初始條件t=0時(shí)，S=S0。求解式（12）的微分方程，可得：

其中，S為底物濃度（g/L）；S0為底物初始濃度（g/L）；μm為最大比生長(zhǎng)速率（h-1）；X0為菌體初始濃度（g/L）；Xm為菌體生長(zhǎng)上限（g/L）；利用MATLAB軟件對(duì)實(shí)際測(cè)得的產(chǎn)物埃博霉素B產(chǎn)量數(shù)值進(jìn)行擬合并通過(guò)參數(shù)修正，求得：k1=0.063 8；k2=0.013；分別將k1、k2、μm、X0和Xm的值代入式（12），經(jīng)整理得到菌株SoF5-76的埃博霉素B生成動(dòng)力學(xué)模型為：

將底物消耗擬合曲線與實(shí)驗(yàn)所測(cè)值相比較，結(jié)果（圖4）顯示，底物消耗擬合模型曲線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合情況比較理想，能夠較好地反映分批發(fā)酵過(guò)程中底物（葡萄糖）消耗的情況。模型在95%的置信區(qū)間內(nèi)，經(jīng)F檢驗(yàn)后顯著性很高，R2=0.995，即模型在99.5%的概率水平上是非常顯著的。表明方程擬合較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值之間具有較好的一致性。這說(shuō)明該模型可作為SoF5-76的底物消耗動(dòng)力學(xué)模型公式。

圖4 底物消耗擬合曲線與實(shí)驗(yàn)測(cè)得值的比較

2.3 模型的驗(yàn)證

在與上述相同發(fā)酵條件下，重復(fù)進(jìn)行分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)值與計(jì)算值相比較結(jié)果（表1）顯示，菌體干重、埃博霉素B產(chǎn)量和葡萄糖消耗模型計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的平均相對(duì)誤差分別為2.36%、5.89%和 5.24%，能夠較好地反映實(shí)際的發(fā)酵過(guò)程。

表1 分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型誤差檢驗(yàn)

3 討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保藏的纖維堆囊菌SoF5-76在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵生成埃博霉素B的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，構(gòu)建了動(dòng)力學(xué)模型，埃博霉素B發(fā)酵除個(gè)別數(shù)據(jù)點(diǎn)外，大部分?jǐn)?shù)據(jù)都能很好地?cái)M合（計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值之間的相對(duì)誤差低于10%），因此該模型能較好地描述纖維堆囊菌SoF5-76發(fā)酵過(guò)程規(guī)律。但實(shí)驗(yàn)中存在一些問(wèn)題和不足有待解決：其一，初始菌體數(shù)量較少，產(chǎn)量較低，并且菌體與樹(shù)脂很難充分分離，致使測(cè)量上有一定的誤差，計(jì)算模型平均誤差時(shí)可以忽略；其二，數(shù)據(jù)測(cè)定存在誤差，如在攪拌過(guò)程中，剪切力及樹(shù)脂之間的相互碰撞對(duì)其物理結(jié)構(gòu)和性能產(chǎn)生較大的影響，導(dǎo)致樹(shù)脂的利用率大大降低［11］；其三，樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液中其他物質(zhì)的非特異性吸附，導(dǎo)致其對(duì)埃博霉素B的吸附量減少，使得計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值之間存在偏差；其四，粘細(xì)菌特殊的多細(xì)胞行為，在發(fā)酵液中成團(tuán)生長(zhǎng)［19］，且在發(fā)酵罐中發(fā)酵時(shí)，菌體在發(fā)酵罐內(nèi)壁粘附，并逐漸向上蔓延，貼壁菌體無(wú)法回到發(fā)酵液中，極大地影響了菌體的生長(zhǎng)［20］；此外，在發(fā)酵即將結(jié)束階段，由底物消耗方程得到的最終底物濃度較實(shí)測(cè)值低，使得實(shí)際發(fā)酵時(shí)間比模型預(yù)測(cè)發(fā)酵時(shí)間有所延長(zhǎng)。這些問(wèn)題極大地限制了埃博霉素B的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。龔國(guó)利等［21］曾在搖瓶試驗(yàn)中將多孔陶瓷應(yīng)用于固定化纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B，使埃博霉素B的產(chǎn)量與未采用多孔陶瓷相比提高了近4倍。于是我們提出以下假設(shè)：在發(fā)酵罐中采用固定化技術(shù)，使菌體附著于固體表面生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物則在發(fā)酵液中，這不僅可以解決菌體在發(fā)酵罐內(nèi)壁粘附，而且可以替代樹(shù)脂在發(fā)酵過(guò)程中吸附率下降等問(wèn)題。

4 結(jié)論

本研究以Logistic、Luedeking-Piret等方程為基礎(chǔ)，建立了埃博霉素B發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)模型、產(chǎn)物生成模型和底物糖消耗模型，并利用MATLAB軟件進(jìn)行非線性擬合。結(jié)果表明，各模型擬合的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.997、0.964和0995，均接近1，說(shuō)明擬合結(jié)果良好，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行模型驗(yàn)證，相對(duì)誤差都較小。所構(gòu)建模型一定程度上能較好反映纖維堆囊菌分批發(fā)酵埃博霉素B過(guò)程規(guī)律，可以為工業(yè)生產(chǎn)規(guī)?；瘧?yīng)用提供理論依據(jù)。

［1］韓莉莉， 盧育新， 王赫， 等.培養(yǎng)基組成對(duì)纖維對(duì)囊菌產(chǎn)埃博霉素的影響［J］.微生物學(xué)雜志， 2008， 28（6）：103-106.

［2］Goodin S， Kane MP， Rubin EH. Epothilones：mechanism of action and biologic activity ［J］. Journal of Clinical Oncology， 2004， 22：2015-2025.

［3］Altmann KH. Recent developments in the chemical biology of epothilones［J］. Curr Pharm Des， 2005， 11：1595-1613.

［4］吳悅， 李強(qiáng)， 林燕， 等.酵母乙醇發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型研究［J］.可再生能源， 2014， 32（2）：229-233.

［5］龔國(guó)利， 陳松， 李慧， 等.基因組重組技術(shù)選育埃博霉素B高產(chǎn)菌株［J］.中國(guó)抗生素雜志， 2013， 38（2）：106-110.

［6］ 龔國(guó)利， 王娜， 劉麗麗.響應(yīng)面法優(yōu)化纖維堆囊菌SoF5-76產(chǎn)埃博霉素B發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.生物技術(shù)通報(bào)， 2014（1）：171-176.

［7］龔國(guó)利， 王娜， 劉麗麗.纖維堆囊菌產(chǎn)埃博霉素B的發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 32（1）：128-132.

［8］龔國(guó)利， 劉麗麗， 王娜.用于吸附固定纖維堆囊菌的硅藻土基多孔陶瓷制備［J］.現(xiàn)代化工， 2013， 33（11）：66-70.

［9］Sang WP， Se JH， Kimb DS， et al. Improvement of epothilone B production by in situ removal of ammonium using cation exchange resin in Sorangium cellulosum culture ［J］. Biochemical Engineering Journal， 2007， 37：328-331.

［10］Gong GL， Sun X， Liu， XL， et al. Mutation of Sorangium cellulosum and a high-throughput screening method for improving the production of Epothilones ［J］. J Ind Microbiol Biotechnol， 2007，34：615-623.

［11］Frykman S， Tsuruta H， Galazzo J， et al. Characterization of product capture resin during microbial cultivations ［J］. J Ind Microbiol Biotechnol， 2006， 33：445-453.

［12］Frykman S， Tsuruta H， Licari P. Assessment of Fed-Batch，semicontinuous， and continuous Epothilone D production processes［J］. Biotechnol Prog， 2005， 21：1102-1108.

［13］周德慶.微生物學(xué)教程［M］.北京：高等教育出版社， 2002.

［14］楊貴明， 蔣愛(ài)華， 薛秋生.用DNS光度法測(cè)定還原糖的條件研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 34（14）：3258-3264.

［15］龔國(guó)利.粘細(xì)菌的Genome shuffling育種技術(shù)及其埃博霉素的高產(chǎn)菌株改良［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)， 2007.

［16］ 龔軍輝. Logistic方程的推導(dǎo)及生物學(xué)意義［J］.高等函授學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2008， 22（1）：48-50.

［17］徐瑩， 何國(guó)慶.彈力蛋白酶分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2007， 1（1）：138-141.

［18］賈士儒.生物反應(yīng)工程原理［M］.北京：科學(xué)出版社， 2002.

［19］曹文瑞.纖維堆囊菌GSUV-205發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素過(guò)程中關(guān)鍵因子的探索及優(yōu)化［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)， 2011.

［20］劉新利， 趙林， 胡瑋， 等.纖維堆囊菌合成埃博霉素專用氣升式發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)優(yōu)化［C］. 2010 First International Conference on Cellular， Molecular Biology， Biophysics and Bioengineering（CMBB）， 2010：540-544.

［21］龔國(guó)利， 劉麗麗， 王娜.多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵制備埃博霉素［J］.中國(guó)生物工程雜志， 2014， 34：109-113.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Kinetics of Batch Fermentation of Epothilone B by Sorangium cellulosum SoF5-76

Ma Liyun Gong Guoli Wang Na
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science & Technology，Xi’an 710021）

The fermentation system produced epothilone is complex， and the production strain is more difficult to operate， leading to difficulties in fermentation parameters measured， so far there is no reporting on Epothilone fermentation kinetics. In this paper， the batch fermentation kinetics of the epothilone B produced by Sorangium cellulosum SoF5-76 was studied in a 5 L fermentor. During the process， the temperature and pH were almost constant， 30℃， 7.4. When the fermentation finished， the dry cell weight， epothilone B production and residual glycerol could reach 3.00 g/L， 18.20 mg/L and 0.049 g/L. On the bases of Logistic and Luedking-Piret equation， the models of cell growth，epothilone B production and substrate consumption were established， and the non-line fitting was employed to model the kinetics of fermentation by software MATLAB. The results show that the kinetic models were in good agreement with the fermentation process.

Sorangium cellulosum；epothilone B；batch fermentation；kinetic models；MATLAB；non-line fitting

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.030

2014-06-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20906058），陜西科技大學(xué)學(xué)術(shù)骨干培育項(xiàng)目（XSG2010009）

馬利云，男，碩士，研究方向：微生物制藥；E-mail：mayun919585594@163.com

龔國(guó)利，男，博士，教授，研究方向：工業(yè)微生物發(fā)酵工程技術(shù)；E-mail：gongguoli@sust.edu.cn