實(shí)時熒光定量PCR檢測TB-DNA與痰涂片在肺結(jié)核診斷中的比較研究

廣東省梅州市人民醫(yī)院（514031）鄭志遠(yuǎn)

肺結(jié)核是結(jié)核分歧桿菌感染引發(fā)的肺部傳染性疾病，多通過呼吸系統(tǒng)傳播，是一項(xiàng)嚴(yán)峻的全球性衛(wèi)生問題，發(fā)病人數(shù)呈增長趨勢。結(jié)核菌感染后不一定發(fā)病，但當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時則疾病發(fā)作[1][2]。由于結(jié)核菌株的不斷進(jìn)化，其耐藥性增強(qiáng)，增加了治療難度，因此及時的檢測診斷才能夠有效地避免肺結(jié)核的擴(kuò)展趨勢。臨床常用的病原學(xué)檢測手段為痰涂片，雖然方便快捷，但其檢測敏感性差，并不能成為結(jié)核病診斷的有效輔助手段，結(jié)核菌分離培養(yǎng)目前是肺結(jié)核疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。肺結(jié)核病人中痰菌陰性表達(dá)的比例較大，因此對于高敏感性檢測手段的選擇尤為重要。本文采用實(shí)時熒光定量PCR檢測TBDNA的方法診斷肺結(jié)核進(jìn)行研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2013年3月～2014年9月期間確診為肺結(jié)核患者106例，其中男性56例，女性50例，年齡：37～55歲，平均年齡（45.33±7.19）歲。選取同期非結(jié)核性肺部疾病患者152例，其中男性79例，女性73例，年齡：36～51歲，平均年齡（43.20±7.24）歲。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測TB-DNA及痰涂片兩種方法對入組患者進(jìn)行檢測，比較兩種檢測方法與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性，計(jì)算并比較兩種檢測方法的靈敏性和特異性。確診組患者均為根據(jù)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288-2008）的金標(biāo)準(zhǔn)而確診的病例[4]，對照組患者均為非結(jié)核性肺部疾病患者，包括肺炎83例，肺部腫瘤39例，慢阻肺18例，肺不張12例。兩組患者其它基本資料無差異（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 本研究中使用的PCR檢測儀為Roche LightCycler，試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，該試劑亦為廣州達(dá)安生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸檢驗(yàn)試劑盒（PCR—熒光法）。

1.2.2 實(shí)時熒光定量檢測TB-DNA 采集外周血，肝素抗凝，2微升樣品加入專用毛細(xì)管中，4000r/min離心3分鐘，插入圓形卡盤倒置20s。使用中山大學(xué)達(dá)安基因公司提供的試劑盒提取DNA，使用PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置循環(huán)參數(shù)為：93度→2分鐘變性，然后按93度5秒→57度45秒，做40個循環(huán)，最后置37度延伸1秒（見附表1）。敏感性、特異性的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：熒光定量PCR擴(kuò)增曲線規(guī)則，呈對數(shù)增長，Ct值≤36 即可判定為陽性; 如擴(kuò)增曲線不規(guī)則或Ct值＞40，報(bào)告為陰性; 如Ct值在36～40，且擴(kuò)增曲線呈對數(shù)增長，樣本重復(fù)測定，如Ct值仍在36～40之間報(bào)告為陰性。

附表1 循環(huán)參數(shù)

附表2 實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)確診比較

附表3 痰涂片檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)確診比較

1.2.3 痰涂片方法 收集清晨深咳濃痰，涂片后進(jìn)行抗酸桿菌染色，高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)，100個高倍視野下菌落≥3個為陽性。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，采用Kappa一致性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)兩種方法與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性，Kappa值取值為0～1，越接近1，一致性越優(yōu)，在這里，越接近1，檢出效果越好。其中，Kappa≥0.75兩者一致性較好；0.75＞Kappa≥0.6兩者一致性一般；0.6＞Kappa≥0.4，兩者一致性可接受；Kappa＜0.4，兩者一致性較差。靈敏度計(jì)算：靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))；特異度計(jì)算：特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)確診比較 在樣本總體中，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測出陽性結(jié)果例數(shù)81例，陰性例數(shù)177例，其中真陽性例數(shù)為77例，真陰性例數(shù)為148例，其中假陽性例數(shù)為4例，假陰性例數(shù)為29例。實(shí)時熒光定量PCR檢測：靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))=77/（77+29）=72.64%；特異度計(jì)算：特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）=148/(148+4)=97.37%，通過Kappa一致性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Kappa=0.726，實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)確診比較兩者一致性一般。具體見附表2。

2.2 痰涂片檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)確診比較 在樣本總體中，通過痰涂片檢測結(jié)果出陽性例數(shù)43例，陰性例數(shù)215例，其中真陽性例數(shù)為31例，真陰性例數(shù)為140例，其中假陽性例數(shù)為12例，假陰性例數(shù)為75例。痰涂片檢測：靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))=31/(31+75)=29.25%；特異度計(jì)算：特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))=140/(140+12)=92.10%，通過Kappa一致性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Kappa=0.235，痰涂片檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)確診比較兩者一致性較差。具體見附表3。

通過比較兩者與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)確診比較兩者一致性一般，痰涂片法檢驗(yàn)結(jié)果一致性較差，實(shí)時熒光定量PCR檢測方法效果更優(yōu)。

3 討論

肺結(jié)核的擴(kuò)展趨勢逐年增長，對于該病的早期檢測診斷非常重要。臨床檢測手段較多，但是在結(jié)核菌感染的最初階段檢測結(jié)果并不能令人滿意。痰涂片操作簡單，但因操作者的主觀性及涂片、染色過程中的誤差而降低了檢測的敏感性[5][6]。痰培養(yǎng)通過專門的培養(yǎng)皿，在合適的外界環(huán)境下，進(jìn)行菌群培養(yǎng)，應(yīng)用了致病菌應(yīng)高于污染菌的原理，是目前臨床中的金標(biāo)準(zhǔn)。但其培養(yǎng)周期較長，假陰、假陽性結(jié)果較多，且對于其他組織器官結(jié)核性疾病的檢測較為繁瑣。PPD試驗(yàn)應(yīng)用也比較廣泛，其通過致病菌導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞，在再次接觸致病菌時會出現(xiàn)扁他反應(yīng)，從而在皮膚表面出現(xiàn)表達(dá)。其操作快捷，但其敏感性、特異性都不夠理想，主要是由于免疫系統(tǒng)及交叉反應(yīng)產(chǎn)生誤差，僅能作為一種臨床診斷的輔助手段[7][8]。

常規(guī)PCR的操作檢測血清DNA過程不具有高敏感、高特異的效果。實(shí)時熒光定量PCR檢測TB-DNA方法是通過熒光化學(xué)物質(zhì)檢測PCR循環(huán)產(chǎn)物，通過內(nèi)參或外參對樣品特定DNA序列進(jìn)行定量分析。其操作過程更為快捷且敏感性、特異性較高。本研究中通過對肺結(jié)核患者的結(jié)核桿菌檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)時熒光定量PCR檢測TB-DNA方法在檢測肺結(jié)核患者時靈敏度較高，達(dá)到72.64%，明顯優(yōu)于痰涂片方法[9][10]。在對非結(jié)核性肺疾病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)時熒光定量PCR檢測TB-DNA方法與痰涂片的特異性均較高并無明顯差別。痰涂片敏感性較低主要因?yàn)樘狄褐薪Y(jié)核分歧桿菌的分布不均勻?qū)е掠^察數(shù)量受限，雖然實(shí)時熒光定量PCR檢測TB-DNA靈敏度和特異度較痰涂片檢測更高，但與金標(biāo)準(zhǔn)比較，一致性僅為一般，仍有漏診病例出現(xiàn)，靈敏度仍不高，假陰性例數(shù)較多，因此該手段作為診斷肺結(jié)核的輔助手段效果優(yōu)于痰涂片，但仍然不能作為肺結(jié)核確診的依據(jù)。曹冉冉[11]等對非典型結(jié)核患者纖支液研究中發(fā)現(xiàn)，使用實(shí)時熒光定量PCR檢測其灌洗液中TB-DNA陽性檢出率8.54%，痰涂片陽性檢出率為2.28%，實(shí)時熒光定量PCR定量檢測TB-DNA能夠明顯提高結(jié)核桿菌的檢出率。賀松等相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，TB-DNA在肺結(jié)核的檢測敏感性為71.54%，痰涂片為26.15%，TB-DNA檢測法有明顯優(yōu)勢，但T-SPOT.TB檢測敏感性達(dá)到92.31%，明顯優(yōu)于前兩種方法，亦與本文的相關(guān)報(bào)道基本一致。

綜上，本研究中可以證明實(shí)時熒光定量PCR檢測TB-DNA在肺結(jié)核疾病診斷中具有良好的輔助作用，其靈敏度和特異度，以及與金標(biāo)準(zhǔn)對比的一致性，均明顯優(yōu)于痰涂片檢測方法，但仍然有部分的漏診例數(shù)，與金標(biāo)準(zhǔn)對比，一致性僅一般，未達(dá)kappa值大于0.75以上，并不能作為肺結(jié)核疾病的確診依據(jù)。但是在肺結(jié)核患者早期的檢測、預(yù)防上還是具有相當(dāng)高的指導(dǎo)價(jià)值，應(yīng)當(dāng)大力推廣使用，以期達(dá)到肺結(jié)核疾病的早預(yù)防、早診斷，在源頭控制住結(jié)核性疾病的傳播。