酸/堿溶解-等電點沉淀法回收羅非魚蛋白的工藝優(yōu)化及蛋白組成分析

周春霞，劉詩長，王瑛，鄭惠娜，洪鵬志

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東湛江524088）

酸/堿溶解-等電點沉淀法回收羅非魚蛋白的工藝優(yōu)化及蛋白組成分析

周春霞，劉詩長，王瑛，鄭惠娜，洪鵬志*

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，
水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東湛江524088）

以羅非魚（Oreochromis niloticus）肉為原料，采用酸/堿溶解-等電點沉淀法回收羅非魚肌肉蛋白，主要探討溶解pH值、料液比和溶解時間對可溶性蛋白得率以及沉淀pH值對可溶性蛋白沉淀得率及蛋白亞基組成的影響.結(jié)果表明，酸/堿溶解回收羅非魚肉可溶性蛋白的最佳pH值為pH 2.0、3.0、11.0和12.0，料液比1∶9（ω/v），溶解時間10 min，可溶性蛋白種類齊全，包含了典型的魚蛋白電泳條帶；酸/堿可溶性蛋白的最佳沉淀條件為pH 5.5，在此條件下，溶解-沉淀過程的蛋白得率分別為61.59%-64.95%.與魚肉蛋白相比，四種分離蛋白中鹽溶性蛋白的比例均升高，水溶性蛋白的比例均降低（p＜0.05）.比較而言，堿溶-等電點沉淀過程中魚蛋白的變性程度較小，其水溶性組分和鹽溶性組分所占的比例均較高，組成相對比較齊全，而酸提蛋白中肌球蛋白重鏈部分降解，少量肌漿蛋白損失.因此，堿溶-等電點沉淀法更有利于回收魚肉分離蛋白.

羅非魚肉；酸堿溶解-等電點沉淀；提取工藝；分離蛋白；蛋白組成

到目前為止，有關(guān)酸堿處理的工藝流程、分離蛋白的得率、凝膠性、白度、脂肪氧化、凍藏穩(wěn)定性及其在全魚和魚品加工下腳料蛋白提取中的應(yīng)用等都有了廣泛研究［2-3］.酸/堿溶解-等電點沉淀法已用于提取鯡魚［4］、巖魚［5］、鯰魚［6］、鱈魚［7］、羅非魚［8-10］、鰱魚［11-12］肌肉蛋白、回收虹鱒魚魚片加工下腳料蛋白［13-14］及魚糜加工廢水的肌漿蛋白［15］等.但與傳統(tǒng)的魚糜加工過程相比，極端酸/堿處理會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，且通常認(rèn)為化學(xué)變性對蛋白質(zhì)的功能特性可能有不利的影響.因此，從理論的角度分析，酸堿調(diào)節(jié)處理制備的分離蛋白很可能功能特性較差.與傳統(tǒng)水洗法制備的羅非魚魚糜比較，酸堿法提取的分離蛋白凝膠強度較差，酸溶-等電點沉淀蛋白中肌原纖維蛋白部分降解［9］.然而，有研究顯示，與傳統(tǒng)的水洗魚糜相比，酸堿處理肌原纖維蛋白可以改善其凝膠形成能力，且堿處理改善色澤和凝膠特性的效果更加明顯［4-5，7-8，10］，而關(guān)于功能特性改善的機理及變化規(guī)律研究相對較少.為此，本研究以大宗養(yǎng)殖羅非魚為原料，采用酸/堿溶解-等電點沉淀法回收羅非魚肌肉蛋白，探討其高效回收魚蛋白的工藝條件、回收蛋白的組成及變化，為低值魚蛋白資源的高值化利用提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料與試劑

羅非魚，湛江東風(fēng)水產(chǎn)市場購買，在實驗室去內(nèi)臟、取背部白肉、清洗、瀝干、絞碎、分裝（150 g/袋），于-18℃冷凍保存，一個星期內(nèi)使用，凱氏定氮法檢測其粗蛋白含量為（16.40±0.06）%.

1.2酸/堿溶解-等電點沉淀法提取蛋白的工藝流程

羅非魚肉→取樣解凍→按一定比例加冰水→高速均質(zhì)（2 min）→調(diào)節(jié)pH值→低溫攪拌（400r/min）溶解一定時間→離心（10000 r/min，20 min，4℃）→取上清液→調(diào)節(jié)pH值使其沉淀→離心（10000 r/ min，20 min，4℃）→取沉淀.整個提取分離過程均在10℃以下進行，提取時間控制在90 min內(nèi).

1.3pH溶解曲線試驗

按照上述提取流程，固定料液比1∶9（ω/v），調(diào)pH值2～12（變化區(qū)間為0.5或1個pH單位），溶解離心后收集上清液，采用雙縮脲法測定上清液蛋白含量.以pH值-上清液中可溶性蛋白含量作圖.

1.4羅非魚肉蛋白最適溶解條件試驗

在確定的最佳酸溶和堿溶pH值范圍內(nèi)，考察不同溶解pH值、料液比（1∶3、1∶6、1∶9和1∶12）和溶解時間（10～60 min）對羅非魚肉可溶性蛋白得率的影響.溶解過程的蛋白得率用上清液中粗蛋白含量占原料粗蛋白含量的百分比來表示，其蛋白含量采用凱氏定氮法檢測.

1.5可溶性蛋白最佳沉淀條件試驗

訓(xùn)練過程中，程序遇到被勿分類的點，會沿著梯度下降的方向重新修改超平面的權(quán)重w1，w2和閾值b以適應(yīng)新的環(huán)境[19].訓(xùn)練反復(fù)迭代，直到所有樣本都被分類正確.感知機模型訓(xùn)練程序流程圖見圖4.

在確定的最佳提取條件下提取羅非魚肉可溶性蛋白，考察沉淀pH值對可溶性蛋白沉淀得率的影響.沉淀過程的蛋白得率用沉淀中粗蛋白含量占可溶性蛋白總量的百分比來表示，其蛋白含量采用凱氏定氮法檢測.

1.6SDS-PAGE電泳

對不同溶解條件下的可溶性蛋白（等體積）和不同沉淀條件下的沉淀蛋白（等蛋白量）進行SDSPAGE電泳［7］分析.實驗所用分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%.

1.7水溶性和鹽溶性組分的分離

絞碎后的羅非魚肉及分離蛋白分散于4倍體積的去離子水中，高速勻漿5 min后離心（10000 r/min，20 min，4℃），收集上清液，將沉淀分散于4倍體積的去離子水中，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液即為水溶性蛋白；提取水溶性蛋白后的沉淀分散于4倍體積的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4，0.6 mol/L Na?Cl）中，高速組織勻漿機勻漿5 min，4℃下浸提18 h（不時攪拌），離心（10000 r/min，20 min，4℃），所得上清液即為鹽溶性蛋白，沉淀為不溶性蛋白.

2　結(jié)果與討論

2.1羅非魚肉蛋白酸/堿溶解條件的確定

2.1.1pH溶解曲線的確定

圖1　羅非魚肉蛋白pH溶解曲線圖Fig.1Solubility profiles of tilapia muslce protein at a various pH

2.1.2酸/堿可溶性蛋白的SDS-PAGE分析

上述各pH條件下提取的羅非魚肉可溶性蛋白，分別取等體積的蛋白溶液進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2.由圖可知，在pH 2.0～4.0或10.0～12.0條件下，在分子量為200kDa、44.3kDa、44.3kDa～29.0kDa和14.3kDa處均出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，分別對應(yīng)肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、肌漿蛋白和小分子水溶性蛋白［16］，表明酸/堿提取過程中可溶性蛋白含量高，種類齊全，且隨著pH值的升高或降低，可溶性蛋白含量逐漸增大.而在pH 5.0～6.0范圍內(nèi)，等體積的蛋白溶液在電泳圖上幾乎沒有明顯的蛋白條帶，表明上清液中蛋白含量極少，蛋白溶出率低.總的分析結(jié)果與pH溶解曲線的變化趨勢大致相同，由此進一步確定羅非魚蛋白溶解的最佳條件在pH≤3.0或pH≥10.0，而最佳沉淀條件在pH 5.0～6.0.

2.1.3溶解pH值對可溶性蛋白得率的影響

圖2　不同pH條件下可溶性蛋白的SDS-PAGE圖Fig.2SDS-PAGE patterns of soluble protein at various pH

以羅非魚魚肉為原料，在料液比1∶9，pH 2.0、3.0和11.0、12.0條件下低溫溶解10min，其可溶性蛋白得率見圖3.由圖可知，在四種偏離等電點的極端pH值條件下，可溶性蛋白得率較高，達(dá)62.89%～75.86%.比較而言，堿性條件下的得率更高，pH 12.0時可溶性蛋白得率達(dá)75.86%.堿性處理回收蛋白質(zhì)的效果很可能優(yōu)于酸性處理［8，10］，酸處理在相當(dāng)大的程度上引起硫醇氧化和蛋白質(zhì)疏水基團的外露，導(dǎo)致蛋白的聚集而導(dǎo)致溶解性降低［9］.但總體而言，四個pH值條件下可溶性蛋白得率差異不明顯（p＞0.05），因此，選擇這四種溶解pH值進一步試驗.

2.1.4料液比對可溶性蛋白得率的影響

在pH 2.0、3.0和11.0、12.0條件下低溫溶解10 min，試驗料液比對羅非魚肉可溶性蛋白得率的影響，結(jié)果如圖4所示.由圖可知，在實驗范圍內(nèi)，隨著料液比的降低，可溶性蛋白得率增大（p＜0.05），而當(dāng)料液比達(dá)到1∶9后，隨著溶液體積的增加，可溶性蛋白得率增加幅度很小，料液比對魚肉蛋白溶解性的影響主要與蛋白質(zhì)分子表面親水基團和水化層的形成有關(guān)，蛋白質(zhì)分子表面有許多親水基團，使其表面形成一個水化層，使蛋白質(zhì)顆粒彼此不容易接近［12］，因此，溶劑量越大，蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性越好，溶解度越高，但溶劑量增加到一定程度后，溶解度的增加不明顯.綜合得率和實際操作及成本，確定進一步實驗的料液比為1∶9.

圖3　溶解pH值對羅非魚肉可溶性蛋白得率的影響Fig.3Effect of dissolved pH value on solubleprotein yield from tilapia muscle

2.1.5溶解時間對可溶性蛋白得率的影響

酸/堿溶解時間對羅非魚肉可溶性蛋白得率的影響如圖5所示.由圖可知，在實驗時間范圍下，隨著溶解時間的延長，魚蛋白的溶解度略有增大，但整體變化不明顯（p＞0.05），由此表明魚蛋白在極端酸性和堿性條件下的展開和溶解很可能在快速進行.另外，為了盡可能的避免魚蛋白的水解變性，溶解時間確定為10 min，整個實驗處理時間控制在90 min以內(nèi).綜合分析，酸/堿溶解-等電點沉淀法提取羅非魚肉蛋白的最佳溶解條件為：pH值為2.0、3.0、11.0和12.0、料液比為1∶9、溶解時間10 min.

圖4　料液比對羅非魚肉可溶性蛋白得率的影響Fig.4Effect of ratio of raw material to extracting madia on soluble protein yield from tilapia muscle

圖5　提取時間對羅非魚肉可溶性蛋白得率的影響Fig.5Effect of extracting time on soluble protein yield from tilapia muscle

2.2羅非魚肉酸/堿可溶性蛋白沉淀條件的確定

以羅非魚肉為原料，在最佳提取條件下提取酸/堿可溶性蛋白，將可溶性蛋白溶液調(diào)至pH 5.0、5.5、6.0使其沉淀，其可溶性蛋白沉淀得率如圖6所示.由圖可知，四種可溶性蛋白溶液均在pH=5.5條件下沉淀得率最高，接近90%，由此確定酸/堿可溶性蛋白最適沉淀pH值為5.5，也進一步表明酸/堿可溶性蛋白的等電點很可能在pH=5.5左右；比較而言，在pH= 5.5條件下，酸溶蛋白比堿溶蛋白的沉淀得率稍高，但差異并不明顯（p＞0.05）.總體分析，在pH調(diào)節(jié)法法提取蛋白的酸/堿溶解過程中，極端酸性條件引起蛋白變性和聚集［9］，導(dǎo)致酸溶蛋白的得率比堿溶蛋白的得率要低，而在沉淀過程中，也正因為酸性條件下引起蛋白的變性和聚集，導(dǎo)致酸溶蛋白的沉淀得率較高.由此導(dǎo)致整個提?。ㄈ芙?沉淀）過程蛋白得率差異不明顯.

圖6　沉淀pH值對羅非魚肉酸/堿可溶性蛋白沉淀得率的影響Fig.6Effect of pH value on precipitating yield of acid/alkali-soluble protein from tilapia muscle

綜上分析，確定酸/堿溶解-等電點沉淀法提取羅非魚肉分離蛋白的溶解pH值為pH 2.0、3.0、11.0和12.0，料液比1∶9，溶解時間10min，酸/堿可溶性蛋白的最佳沉淀條件為pH 5.5，其提取蛋白得率分別為61.59%、56.06%、56.53%和64.95%.

2.3羅非魚肉分離蛋白的制備及組成分析

2.3.1分離蛋白水溶性和鹽溶性蛋白的比例

分別在極端酸性（pH 2.0和3.0）和堿性（pH 11.0和12.0）條件下溶解，然后pH 5.5條件下沉淀，冷凍干燥制備了四種分離蛋白粉，其干基蛋白含量在95%以上（數(shù)據(jù)未列出），灰分和脂肪含量低.進一步對四種分離蛋白的水溶性和鹽溶性蛋白進行提取和檢測，結(jié)果如圖7所示.由圖可知，各分離蛋白中鹽溶性蛋白含量均明顯高于水溶性蛋白含量（p＜0.05），由此表明酸/堿溶解-等電點沉淀法可以有效回收魚肉中的鹽溶性蛋白及部分水溶性蛋白；比較而言，堿溶-等電點沉淀蛋白中水溶性和鹽溶性蛋白的含量均高于酸溶-等電點沉淀蛋白，尤其是pH 11.0-5.5條件下提取的分離蛋白中鹽溶性蛋白含量超過80%.由此進一步表明堿法提取過程中魚蛋白的變性程度較小，回收蛋白質(zhì)的性質(zhì)較好.另外，與魚肉蛋白相比，四種分離蛋白中水溶性組分的含量均降低（p＜0.05），表明在等電點沉淀過程中部分水溶性蛋白成分損失或變性為不溶性組分，使沉淀后的上清液中小分子蛋白含量減少；分離蛋白的不溶性蛋白組分均高于魚肉蛋白，這可能與可溶性蛋白提取過程的變性聚集有關(guān)，且酸提蛋白的不溶性組分比例更告，進一步表明酸溶-等電點沉淀過程中蛋白質(zhì)變性更為明顯.

2.3.2分離蛋白的SDS-PAGE電泳分析

分別提取四種分離蛋白的水溶性和鹽溶性組分進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖8所示.由圖可知，在實驗范圍內(nèi)，分離蛋白中鹽溶性組分的條帶明顯較多，并且在分子量200kDa、44.3kDa、20kDa和14.3kDa附近等處均出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，分別對應(yīng)肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈和小分子水溶性蛋白［16］，表明酸/堿溶解-等電點沉淀法提取的分離蛋白基本上包括了魚肉中大部分的鹽溶性和水溶性蛋白；比較而言，酸溶-等電點沉淀蛋白鹽溶性組分的蛋白條帶明顯較淺，且肌球蛋白重鏈的變化尤為明顯，由此表明極端pH條件影響蛋白質(zhì)的亞基組成和構(gòu)象，尤其是肌球蛋白重鏈的降解［2，7］；水溶性組分的條帶主要分布在分子量44.3～29.0 kDa和20.1～14.3 kDa范圍內(nèi)，為肌漿蛋白和小分子水溶性蛋白等［16］；比較而言，pH 2.0-5.5提取的蛋白水溶性組分的條帶明顯較少，可能與酸提過程中魚肉內(nèi)源酶的破壞有關(guān).總體分析，pH 11.0-5.5條件下提取的分離蛋白變性程度較小，蛋白組分比較齊全.

圖7　羅非魚肉及其分離蛋白中水溶性和鹽溶性蛋白的比例Fig.7Water-soluble and salt-soluble protein proportion in tilapia muscle and protein isolate

圖8　羅非魚肉分離蛋白水溶性和鹽溶性組分的SDS-PAGE圖Fig.8SDS-PAGE patterns of water-soluble and salt-soluble fraction in protein isolate from tilapia muscle

3　結(jié)論

酸/堿溶解-等電點沉淀法提取羅非魚肉蛋白的最佳溶解條件為：pH值2.0、3.0、11.0和12.0、料液比1：9、溶解時間10min；酸/堿可溶性蛋白的最佳沉淀條件為pH 5.5；在此條件下，溶解-沉淀過程的蛋白得率分別為61.59%、56.06%、56.53%和64.95%；分離蛋白組成齊全，顯示了肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈和小分子的水溶性蛋白條帶；比較而言，堿溶-等電點沉淀法提取的蛋白組成相對比較齊全，而堿溶-等電點沉淀提取過程中變性程度較大，肌球蛋白重鏈部分降解，少量肌漿蛋白損失，不溶性組分的比例提高.因此，堿溶-等電點沉淀法更適于回收魚肉分離蛋白.

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責(zé)任編輯：劉紅

Optimizing Recovery and Composition Analysis of Tilapia Protein by Acid/Alkaline Solubilization-isoelectric Precipitation

ZHOU Chunxia，LIU Shichang，WANG Ying，ZHENG Huina，HONG Pengzhi*
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，Zhanjiang 524088，China）

Protein isolates was prepared from tilapia（Oreochromis niloticus）muscle by acid/alkaline solubilization-isoelec?tric precipitation processing in this study.Effect of pH value，ratio of raw material to extracting media and extracting time on soluble protein yield were examined in the extraction process.And then effect of pH value on precipitated protein yield from acid-soluble and alkali-soluble protein and subunit composition was determined as well.Results showed that the optimum dissolution conditions of protein recovery from tilapia muscle were pH 2.0，3.0，11.0，and 12.0，ratio of raw material to ex?tracting media of 1∶9（ω/v），and extraction time of 10 min.The soluble proteins strips included the typical fish protein elec?trophoresis pattern.The optimum precipitation condition of acid-soluble and alkali-soluble protein was pH 5.5.In the above four conditions，the recovered protein yields from Tilapia muscle were 61.59%-64.95%by acid/alkaline solubilization and precipitation processing.Compared with tilapia muscle protein，the higher salt-soluble protein proportion and lower watersoluble protein proportion（p＜0.05）in four protein isolates were obtained.Comparatively，the protein isolates prepared by al?kaline solubilization-isoelectric precipitation has less denaturation and more complete composition，and the water-soluble and salt-soluble protein proportion were higher than those of protein isolates by acid solubilization-isoelectric precipitation. However，partial degradation of myosin and loss of sarcoplasmic protein were observed during acid solubilization-isoelectric precipitation treatment.Therefore，alkali solubilization-isoelectric precipitation process was more suitable for recovery of fish protein isolates.

tilapia muscle；acid/alkaline solubilization-isoelectric precipitation；extraction technology；protein isolates；protein composition酸/堿溶解-等電點沉淀法（acid/alkaline solubili?zation-isoelectric precipitation），也稱pH值調(diào)節(jié)法（pH-shifting）或酸堿法（acidic/alkaline solublization process），是上世紀(jì)90年代末美國學(xué)者Hultin和Kelleher［1］研究出的一種提取動物肌肉蛋白的方法.在低溫偏離蛋白質(zhì)等電點的酸性（pH＜3.5）或堿性（pH＞10.5）條件下使蛋白充分溶解，高速離心除去脂肪和不溶性雜質(zhì)制備可溶性蛋白溶液，然后在等電點條件下使蛋白沉淀，制備分離蛋白.與傳統(tǒng)的魚糜加工相比具有明顯的優(yōu)點：加工處理前不必預(yù)先采肉，不必進行骨肉分離，原料絞碎均質(zhì)后即可直接使用；第二，可以有效提取可溶性肌漿蛋白，蛋白質(zhì)回收率高；第三，極端pH條件下蛋白和油脂充分分離，高速離心可以有效去除中性脂肪和膜脂，降低魚蛋白儲藏過程中的脂肪氧化；第四，酸堿處理提取蛋白過程中，有機廢水中有機質(zhì)含量低，對環(huán)境的污染?。?］.酸/堿溶解-等電點沉淀法也正是在回收蛋白質(zhì)的效率和優(yōu)良功能特性方面表現(xiàn)出的巨大優(yōu)勢，引起相關(guān)研究學(xué)者的廣泛關(guān)注.

TS 254.2

A

1674-4942（2015）04-0390-06

2015-10-19

國家自然科學(xué)基金項目（31201389）；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃資助項目（Yq2013090）