免疫標(biāo)記法在汗?jié)撌钟〉娘@現(xiàn)與成分檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

湯鳳梅，馬榮梁，馮永杰，吳 浩，曲會(huì)英，劉 寰

（1.公安部物證鑒定中心，北京100038；2.遼寧警察學(xué)院，遼寧 大連116036；3.江蘇省公安廳 刑警總隊(duì)，江蘇 南京 210000）

手印是指人手指、掌表面的乳突紋、屈肌褶紋、皺紋等皮膚花紋結(jié)構(gòu)在力的作用下接觸客體時(shí)所形成的能反映花紋結(jié)構(gòu)與外形結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的印痕總稱，包括指頭印、指節(jié)印、手掌印等。手印，作為刑偵領(lǐng)域最重要的物證之一，在人身認(rèn)定中發(fā)揮重要的作用。形成汗?jié)撌钟〉奈镔|(zhì)主要是指掌皮膚汗腺分泌的汗液，包括水、多種無機(jī)物和有機(jī)物，如氯化鈉、尿素和各種氨基酸。汗?jié)撌钟∥镔|(zhì)中實(shí)際上還包括脂類物質(zhì)，如脂肪酸、甘油、固醇等。雖然指掌面沒有皮脂腺，但是人們在日常生活習(xí)慣中會(huì)經(jīng)常接觸皮脂較多的部位（例如頭面部），于是指掌表面的脂類物質(zhì)留存在手印紋線中[1]。

針對(duì)手印物質(zhì)中的各種成分，已經(jīng)建立了粉末顯現(xiàn)法、茚三酮顯現(xiàn)法、DFO顯現(xiàn)法以及502膠熏顯法等傳統(tǒng)方法。在實(shí)際工作中，現(xiàn)場潛在手印的顯現(xiàn)主要存在兩個(gè)難題：一是某些疑難復(fù)雜客體表面上的手印，采用現(xiàn)有方法的顯現(xiàn)效果難以令人滿意；二是手印顯現(xiàn)的靈敏度仍然有待提高，以顯現(xiàn)痕量汗液物質(zhì)形成的手印或陳舊手印等。各國學(xué)者正努力從兩個(gè)方面來解決上述難題：一是研發(fā)新材料、建立新技術(shù)，來提高顯現(xiàn)方法的靈敏度，同時(shí)拓展方法適用客體范圍；二是充分發(fā)掘汗?jié)撌钟√峁┑臐撛谛畔?，不僅僅局限于手印的形態(tài)，更深入研究手印物質(zhì)中的特殊成分，通過對(duì)特殊成分的測定確定嫌疑人的生活習(xí)慣，即通過手印物質(zhì)對(duì)嫌疑人進(jìn)行描繪。因此，免疫標(biāo)記法應(yīng)運(yùn)而生，與傳統(tǒng)方法相比，該方法不僅能夠顯現(xiàn)汗?jié)撌钟?，同時(shí)，基于抗原抗體特異性反應(yīng)，還能完成手印物質(zhì)中某些特定成分的測定，以此作為依據(jù)，推斷嫌疑人接觸過或食用過何種毒品，或者具有哪些生活習(xí)慣，例如吸煙，或者患有某種疾病等。

1 免疫標(biāo)記技術(shù)（Immunolabelling technique）

該技術(shù)是以放射性同位素、熒光素、酶、生物素、膠體金、化學(xué)發(fā)光元素、鐵蛋白等作為示蹤物標(biāo)記抗體（或抗原），通過抗原抗體特異性反應(yīng)，并借助精密儀器對(duì)示蹤物進(jìn)行測定，借此鑒定未知抗原（或抗體）[2]。近年來，針對(duì)汗?jié)撌钟〉娘@現(xiàn)與成分檢測所采用的示蹤物主要以熒光素為主，即采用免疫熒光技術(shù)，該技術(shù)主要分為直接免疫熒光法和間接免疫熒光法。

直接免疫熒光法是將熒光素標(biāo)記的抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。該方法雖然具有簡單、快速、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，但是，針對(duì)每種抗原需制備相應(yīng)的熒光抗體，因此，該方法在汗?jié)撌钟★@現(xiàn)中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

為了克服直接免疫熒光法的不足，發(fā)展了間接免疫熒光法，該方法則是將熒光素標(biāo)記到與一抗特異性結(jié)合的二抗上，制備一種熒光標(biāo)記的二抗。這種二抗可以用于檢測同種動(dòng)物的多種抗原抗體系統(tǒng)，因此，在汗?jié)撌钟〉娘@現(xiàn)中應(yīng)用較多。間接免疫熒光法主要分為三個(gè)步驟：第一步，用未標(biāo)記的一抗進(jìn)行孵育，部分抗體與存在的抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，洗滌去掉未結(jié)合的抗體；第二步，加入熒光標(biāo)記的二抗再次孵育，此時(shí)標(biāo)記的二抗與一抗相結(jié)合，然后，洗滌去掉未結(jié)合的二抗；最后，對(duì)結(jié)合在抗體上的標(biāo)記物進(jìn)行定性。若手印物質(zhì)中有抗原存在時(shí)，標(biāo)記物通常導(dǎo)致熒光手印的生成。當(dāng)無抗原存在時(shí)，則不會(huì)發(fā)生抗原與一抗的結(jié)合，也不會(huì)發(fā)生一抗和二抗試劑的結(jié)合，因此沒有熒光信號(hào)產(chǎn)生。

2 間接免疫標(biāo)記法在汗?jié)撌钟〉娘@現(xiàn)與成分檢測中的應(yīng)用

最早將免疫技術(shù)應(yīng)用于汗?jié)撌钟〉难芯科鹪从?977年，Ishiyam[3]與其研究團(tuán)隊(duì)，針對(duì)分泌型人群（即能分泌血型抗原的人群），利用抗體（凝集素），通過抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，即混合細(xì)胞凝集反應(yīng)（mixed cell agglutination reaction，MCAR），對(duì)透明膠帶粘面上的手印物質(zhì)進(jìn)行血型分析，研究的意外結(jié)果是顯現(xiàn)出汗?jié)撌钟?。Tshiyam等還進(jìn)一步考察紙張客體，采用茚三酮顯現(xiàn)后，繼續(xù)采用MCAR技術(shù)比單獨(dú)使用茚三酮的顯現(xiàn)要靈敏很多，效果有顯著提高。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)免疫標(biāo)記技術(shù)在汗?jié)撌钟〉娘@現(xiàn)與成分檢測的研究主要圍繞以下幾種組分[3]：氨基酸、蛋白質(zhì)和多肽（角蛋白、組織蛋白酶、皮離蛋白、人血清白蛋白等）、尼古丁代謝產(chǎn)物（可替寧）、毒品（四氫大麻酚，美沙酮）及其代謝產(chǎn)物（美沙酮代謝產(chǎn)物EDDP，嗎啡，苯甲酰芽子堿）等。

2.1 氨基酸

手印物質(zhì)中，氨基酸類物質(zhì)濃度可達(dá)0.3～2.5 mg/L。Spindler等[4]利用抗L-氨基酸抗體（anti-L-amino acid antibodies），來顯現(xiàn)鋁箔、玻璃、瓷磚上的汗?jié)撌钟?，原理如圖1所示。首先，分別通過直接吸附法和間接共價(jià)法兩種方法將抗體（一抗）修飾到16 nm的金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）上，制備出抗體修飾的AuNPs溶液。然后，將該溶液滴加到汗?jié)撌钟”砻妫钟∥镔|(zhì)中的氨基酸與AuNPs上的抗體發(fā)生特異性結(jié)合。最后，加入熒光紅610標(biāo)記的二抗，二抗與一抗相結(jié)合。在590nm波長的光源激發(fā)下，通過650nm的濾色片，觀察得到熒光手印。研究表明該方法適合幾個(gè)月以上或者未知手印的顯現(xiàn)，對(duì)3個(gè)月以內(nèi)的新鮮手印顯現(xiàn)效果不好，主要是由于兩個(gè)原因：其一，手印物質(zhì)被免疫試劑溶解并引起擴(kuò)散；其二，采用的沖洗溶劑對(duì)抗體溶解度低，引起的背景染色。后來，作者采用磷酸鹽緩沖溶液作為沖洗溶劑，能有效降低背景染色。

圖1 采用兩種方法制備的功能化金納米粒子顯現(xiàn)汗?jié)撌钟4]（根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，已獲得轉(zhuǎn)載許可，版權(quán)歸 Royal Society of Chemistry所有。）

2.2 蛋白質(zhì)和多肽

與氨基酸相比，對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的研究更為廣泛，主要有以下幾種：角蛋白（Keratin）來自于細(xì)胞脫落過程；組織蛋白酶Cathepsin-D來自于細(xì)胞脫落過程和汗液；皮離蛋白（Dermcidin）來自汗液；人血清白蛋白（Human serum albumin）一種載體蛋白[5]；表皮細(xì)胞生長因子（Epidermal growth factor，EGF）是一種低分子量的多肽，由53個(gè)氨基酸分子組成，在細(xì)胞生長、增殖、分化和修復(fù)中發(fā)揮重要作用；溶菌酶（Lysozyme）是人體汗腺分泌的一種抗菌酶，是免疫系統(tǒng)固有防御體系的一部分，主要通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid，NAM）的 1位碳原子和 N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-d-glucosamine，NAG）的 4 位碳原子間的β1-4糖苷鍵，來破壞革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁[6]。

2009年，Drapel等[5]分別針對(duì)手印物質(zhì)中的角蛋白、組織蛋白酶和皮離蛋白，采用Invitrogen生產(chǎn)的商品化試劑盒Chrome Breeze immunodetection kits，按照試劑盒操作手冊，將聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜和紙張上的手印顯現(xiàn)出來。在此研究基礎(chǔ)上，van Dam等[7]與其研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了更深入的研究。首先，在滲透性的硝酸纖維素膜（NCM）上捺印汗?jié)撌钟?，分別只針對(duì)手印物質(zhì)中的皮離蛋白/人血清白蛋白，采用相應(yīng)的鼠的單克隆IgM抗皮離蛋白抗體/IgG2a抗人血清白蛋白抗體進(jìn)行結(jié)合，在采用異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的羊抗鼠的IgM/IgG二抗與之結(jié)合，在特定波長的光源激發(fā)下，顯現(xiàn)出熒光手印。然后，van Dam等[7]分別采用熒光探針Lightning-Link Rapid DyLight 350和Cy3與兩種抗體相結(jié)合，同時(shí)對(duì)NCM膜/玻璃片上的手印物質(zhì)中的兩種蛋白進(jìn)行標(biāo)記，在不同的波長的光源激發(fā)下，顯現(xiàn)出熒光手印。

由于顯現(xiàn)出的熒光手印只能顯現(xiàn)出兩種蛋白的分布點(diǎn)，間接反映出汗孔的分布，而反映出來的細(xì)節(jié)特征很少，所以，van Dam等[8]進(jìn)一步設(shè)想了該免疫標(biāo)記法是否可以與傳統(tǒng)顯現(xiàn)方法相結(jié)合，先采用傳統(tǒng)方法對(duì)汗?jié)撝讣y進(jìn)行顯現(xiàn)，玻璃片上采用磁性粉顯現(xiàn)，NCM膜上采用茚三酮顯現(xiàn)，然后針對(duì)皮離蛋白，采用熒光免疫標(biāo)記的方法進(jìn)行顯現(xiàn)，NCM膜上的顯現(xiàn)效果（見圖2）。研究結(jié)果表明該免疫標(biāo)記法與這兩種傳統(tǒng)顯現(xiàn)方法具有很好的兼容性，效果上可以互補(bǔ)。針對(duì)NCM膜和玻璃片這兩種客體，van Dam等[9]進(jìn)一步考查了免疫標(biāo)記法與其他傳統(tǒng)手印顯現(xiàn)方法的匹配性。先采用傳統(tǒng)顯現(xiàn)方法，然后針對(duì)手印中的皮離蛋白，采用免疫標(biāo)記法進(jìn)行顯現(xiàn)。其中，滲透性的NCM膜上的手印，采用茚滿二酮-鋅鹽（IND-ZnCl），茚滿二酮-鋅鹽-茚三酮（IND-NIN），物理顯影液（physical developer，PD）進(jìn)行顯現(xiàn)；非滲透性的玻璃片上的手印，采用502膠熏顯，502膠熏顯-基礎(chǔ)黃染色（CABY），熒光502膠熏顯（Lumi-CA）和聚腈基丙烯酸酯熏顯（Poly-CA）進(jìn)行顯現(xiàn)。研究結(jié)果表明只有Lumi-CA和Poly-CA顯現(xiàn)方法不推薦與免疫標(biāo)記相結(jié)合，顯現(xiàn)效果不好。van Dam等[10]還進(jìn)一步考察了免疫標(biāo)記法適用的客體范圍，研究了非滲透客體（鋁箔、不銹鋼鑰匙、塑料瓶、垃圾袋、包裝袋、自封袋），半滲透性客體（瓷磚和薄紙板），滲透性客體（復(fù)印紙和熱敏紙），結(jié)果表明：薄紙板和復(fù)印紙不適合免疫標(biāo)記法顯現(xiàn)，其他客體均能夠顯現(xiàn)出具有鑒定價(jià)值的手??；載體表面的多孔性和疏水性可以影響免疫標(biāo)記方法的應(yīng)用，載體表面孔的尺寸影響手印物質(zhì)的吸附，因此影響抗原的測定；示蹤物的選擇要進(jìn)行試驗(yàn)，有些結(jié)果違反常規(guī)，當(dāng)客體具有熒光性，例如熱敏紙和復(fù)印紙，可以采用辣根過氧化物酶（HRP）代替FITC和Cy3作為示蹤物。

圖2 NCM膜上采用茚三酮顯現(xiàn)與免疫標(biāo)記顯現(xiàn)相兼容[8]（根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，已獲得轉(zhuǎn)載許可，版權(quán)歸 Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA所有）

目前，國內(nèi)采用免疫標(biāo)記法顯現(xiàn)指紋的相關(guān)研究比較少，2014年，He等[6]建立了免疫多金屬沉積（Immunological Multimetal Deposition，iMMD）顯現(xiàn)膠帶上的汗?jié)撌钟〉姆椒?，采用抗體修飾的金納米粒子（antibody-AuNPs）與手印物質(zhì)中的抗原反應(yīng)，然后通過銀染（Silver staining）的方法進(jìn)行顯現(xiàn)出黑色紋線的手印。其中AuNPs不僅作為抗體的載體，用來進(jìn)行識(shí)別生物分子，同時(shí)，也作為自動(dòng)金相沉積的成核點(diǎn)，即單質(zhì)銀在AuNPs表面進(jìn)行沉積。He等采用人免疫球蛋白（Human immunoglobulin G，hIgG）對(duì)膠帶上的汗?jié)撌钟∵M(jìn)行浸染，來優(yōu)化iMMD的反應(yīng)條件。研究發(fā)現(xiàn)：抗原和抗體的結(jié)合時(shí)間增長，顯現(xiàn)效果變好，但是結(jié)合時(shí)間過長，背景顏色也變深，可能是由于AuNPs與底物的非特異性結(jié)合，并且銀染時(shí)引起銀的沉積；免疫反應(yīng)時(shí)的溫度對(duì)iMMD的效果影響不大；顯現(xiàn)效果隨antibody-AuNPs的濃度的增加而增強(qiáng)；銀染時(shí)間長，顯現(xiàn)效果好，但過長背景也變黑了。最后針對(duì)手印物質(zhì)中的表皮細(xì)胞生長因子（Epidermal growth factor，EGF）和溶菌酶（Lysozyme），He 等[6]分別采用對(duì)應(yīng)抗體修飾的金納米粒子進(jìn)行iMMD反應(yīng)，顯現(xiàn)出手印（見圖3）。該方法具有靈敏度高（手印物質(zhì)中ng級(jí)的成分），快速和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

圖3 免疫多金屬沉積法顯現(xiàn)膠帶上的汗?jié)撌钟6]（根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，已獲得轉(zhuǎn)載許可，版權(quán)歸 Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA所有）

2.3 尼古丁代謝產(chǎn)物——可替寧制

針對(duì)吸煙者汗液里的一種尼古丁代謝產(chǎn)物可替寧（cotinine），Russell[11-14]與其研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了深入的研究。Leggett等[11]制備出抗可替寧抗體修飾的納米金顆粒（anti-cotinine AuNPs）：采用雙功能交聯(lián)劑3-（2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SPDP）將protein A交聯(lián)在納米金顆粒上，然后在protein A上交聯(lián)抗可替寧抗體。anti-cotinine AuNPs與手印物質(zhì)中的可替寧發(fā)生抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)，然后加入熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行反應(yīng)，顯現(xiàn)出玻璃片上的汗?jié)撌钟?。將抗可替寧抗體修飾到AuNPs表面，在其表面覆蓋大約50～60個(gè)抗體，提高了抗體抗原結(jié)合物的活性，并為熒光標(biāo)記的二抗提供更多位點(diǎn)，所以熒光信號(hào)增強(qiáng)，可以觀察到二級(jí)特征（細(xì)節(jié)特征）和三級(jí)特征（汗孔）。如果不結(jié)合納米金顆粒，只能證明吸煙經(jīng)歷，但是顯現(xiàn)出手印不具備同一認(rèn)定的條件。在陰性對(duì)照試驗(yàn)中，采用anti-cotinine AuNPs顯現(xiàn)不吸煙者的汗液手印，結(jié)果顯現(xiàn)不出手印，證明抗原與抗體的特異性結(jié)合。在此研究基礎(chǔ)上，Hazarika等[12]建立了15 min快速檢測可替寧的方法：采用商品化的蛋白A/G包覆的磁性顆粒代替納米金顆粒，修飾上抗可替寧抗體，結(jié)合熒光標(biāo)記的二抗，顯現(xiàn)玻璃片上的汗?jié)撌钟?。Hazarika等考察抗體抗原反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯現(xiàn)效果的影響發(fā)現(xiàn)，孵育反應(yīng)10min時(shí)，手印紋線由白色變?yōu)辄S色，所以加上沖洗步驟，可以在15min顯現(xiàn)出玻璃片的汗?jié)撌钟?，并確定可替寧的存在（見圖4）。

圖4 以可替寧為抗原采用免疫標(biāo)記法顯現(xiàn)玻璃片上吸煙者的汗?jié)撌钟12]（根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]，已獲得轉(zhuǎn)載許可，版權(quán)歸 Royal Society of Chemistry所有）

Boddis等[13]將該方法應(yīng)用于白色瓷盤客體，吸煙者汗液中有可替寧存在，能夠顯現(xiàn)出熒光手?。徊晃鼰熣吆挂褐袥]有可替寧，原則上顯現(xiàn)不出手印，但是實(shí)際上顯現(xiàn)出“負(fù)”的結(jié)果，即顯現(xiàn)出熒光手印，但是陰陽紋線顛倒。除了考察免疫標(biāo)記法適用的客體范圍，Boddis等[14]還考察了保存條件對(duì)顯現(xiàn)效果的影響。針對(duì)吸煙者玻璃片上的汗?jié)撌钟?，Boddis等考察了4周內(nèi)，4種不同條件下的顯現(xiàn)效果：室溫光照，室溫黑暗，55℃黑暗，-20℃黑暗。55℃黑暗條件下保存的手印顯現(xiàn)效果最好，可能是去除了揮發(fā)性物質(zhì)，同時(shí)抑制了細(xì)菌對(duì)脂類、蛋白質(zhì)的降解以及鯊烯（squalene）的氧化。而-20℃黑暗，手印顯現(xiàn)質(zhì)量下降，超過2周顯現(xiàn)質(zhì)量不好。室溫光照的情況下，手印物質(zhì)脫水，粘滯性增加，細(xì)菌和UV使其中的脂類和蛋白質(zhì)物質(zhì)發(fā)生氧化，從而引起手印物質(zhì)的降解。在UV下，手印物質(zhì)中的鯊烯發(fā)生過氧化反應(yīng)，生成環(huán)氧化物和過氧化氫物，進(jìn)一步降解生成丙二醛，甲醛，乙醛，丙酮，這些物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)活潑，具有揮發(fā)性，進(jìn)而引起手印物質(zhì)的降解。研究表明手印物質(zhì)降解由光和細(xì)菌共同作用，黑暗條件下，手印物質(zhì)發(fā)生氧化和降解的速度比較慢。

2.4 毒品及其代謝產(chǎn)物

免疫標(biāo)記法在顯現(xiàn)含有可替寧的手印中發(fā)揮了很大的作用，因此，Russell[15-16]與其研究團(tuán)隊(duì)將該方法應(yīng)用于手印中毒品及其代謝產(chǎn)物的檢測。Pompi等[15]分別針對(duì)吸毒者汗?jié)撌钟≈械乃臍浯舐榉樱═HC，大麻的主要成分），美沙酮和其代謝產(chǎn)物（EDDP，2-亞乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基吡咯烷），苯甲酰芽子堿（可卡因的代謝產(chǎn)物），采用商品化的蛋白A/G包覆的磁性顆粒，修飾上對(duì)應(yīng)的抗體，與手印物質(zhì)中的抗原發(fā)生反應(yīng)，然后結(jié)合熒光標(biāo)記的二抗，顯現(xiàn)出手?。ㄒ妶D5）。后來，同時(shí)針對(duì)吸毒者汗?jié)撌钟≈械膯岱龋êＢ逡虻拇x產(chǎn)物）和苯甲酰芽子堿（可卡因的代謝產(chǎn)物），Hazarika等[16]采用商品化的蛋白A/G包覆的磁性顆粒，分別修飾上對(duì)應(yīng)抗體，將手印劃分為兩個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域采用對(duì)應(yīng)的抗體和二抗進(jìn)行反應(yīng)，顯現(xiàn)出手印。該方法能夠同時(shí)證明手印物質(zhì)中存在兩種代謝產(chǎn)物。Russell與其團(tuán)隊(duì)的研究成果在行業(yè)領(lǐng)域中受到高度評(píng)價(jià)[17-18]，該方法有很廣泛的應(yīng)用前景，不僅可以應(yīng)用于可替寧和毒品的檢驗(yàn)，還有望應(yīng)用于爆炸物，以及可以作為診斷指示物的其他代謝產(chǎn)物和激素等。該方法還可能針對(duì)手印物質(zhì)中RNA和DNA，與 STR（short tandem repeat）技術(shù)相結(jié)合。

圖5 以四氫大麻酚為抗原采用免疫標(biāo)記法顯現(xiàn)玻璃片上的汗?jié)撌钟15]（根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]，已獲得轉(zhuǎn)載許可，版權(quán)歸 Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA所有）

3 免疫標(biāo)記法的影響因素

在采用免疫標(biāo)記法顯現(xiàn)汗?jié)撌钟r(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性結(jié)合，特別是采用載體顆粒時(shí)，可能非功能化的顆粒（即沒有抗體修飾的顆粒）也會(huì)顯現(xiàn)出手印，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對(duì)偵查起到誤導(dǎo)作用[7]。以金納米粒子為例，雖然被廣泛用于手印顯現(xiàn)中，但是被手印物質(zhì)吸附的機(jī)理還不明確，目前存在兩種不同的觀點(diǎn)。普遍認(rèn)為是酸性條件下（pH 3左右），手印物質(zhì)中含有氨基基團(tuán)的成分（例如氨基酸、蛋白質(zhì)等）質(zhì)子化，帶正電；金納米粒子由于吸附檸檬酸根離子帶負(fù)電，從而被吸附到手印物質(zhì)上。2014年，Moret[19]和其研究團(tuán)隊(duì)深入的研究納米粒子顯現(xiàn)汗?jié)撌钟〉臋C(jī)理，提出了截然不同的觀點(diǎn)。與金納米顆粒相比，二氧化硅納米顆粒表面更容易被修飾 （例如在其內(nèi)部可以引入染料），能夠研究更多的影響因素，所以Moret等采用二氧化硅納米粒子進(jìn)行機(jī)理研究。通過考察PH、Zeta電位、修飾基團(tuán)（-COOH，-（COOH）2，-SO3H，-OP（O）（ONa）CH3）、離子強(qiáng)度等條件，證明二氧化硅納米粒子被手印物質(zhì)吸附是由于化學(xué)反應(yīng)：納米粒子表面的羥基與手印物質(zhì)的氨基發(fā)生反應(yīng)，生成酰胺鍵，并且此反應(yīng)容易被二酰亞胺類物質(zhì)（如EDC/NHS（N-ethyl-N′-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide）催化。以往的研究報(bào)道已經(jīng)證明，載體顆粒在顯現(xiàn)手印時(shí)起到信號(hào)放大的作用[11]，但是對(duì)非功能化載體顆粒的反應(yīng)機(jī)理缺乏研究，所以，在建立免疫標(biāo)記方法時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要考慮多方面因素。

3.1 如何驗(yàn)證抗原與抗體為特異性結(jié)合

通常采用對(duì)照實(shí)驗(yàn)（Control experiment）來驗(yàn)證抗原抗體的特異性結(jié)合，主要包括陽性對(duì)照（Positive control）、陰性對(duì)照（Negative control）、同型對(duì)照（Isotype control）三種實(shí)驗(yàn)[7]。其中，陽性對(duì)照一般直接采用抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液利用免疫標(biāo)記的方法進(jìn)行顯現(xiàn)標(biāo)記，證明能夠有熒光物質(zhì)生成。陰性對(duì)照，則采用確定不含已知抗原的手印樣本進(jìn)行免疫標(biāo)記。以可替寧為例，它只存在于吸煙者的手印物質(zhì)中，那么陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)則采用不吸煙者的汗?jié)撌钟?，進(jìn)行免疫標(biāo)記，來驗(yàn)證：沒有抗原存在時(shí)，是顯現(xiàn)不出熒光手印的。有時(shí)也做空白對(duì)照，即對(duì)含有抗原的手印樣本，不加一抗或者同時(shí)不加一抗和二抗，來驗(yàn)證二抗是否會(huì)與手印物質(zhì)或者與背景發(fā)生非特異性結(jié)合，以及手印物質(zhì)是否會(huì)自發(fā)熒光?？瞻讓?duì)照也屬于陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。同型對(duì)照則使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，代替一抗。例如標(biāo)記手印物質(zhì)中的皮離蛋白，如果一抗采用鼠的單克隆的IgM抗皮離蛋白抗體，二抗采用羊抗鼠的IgM FITC，則同型對(duì)照可以采用鼠的單克隆的IgM代替一抗，也可以采用鼠的單克隆的IgM FITC同時(shí)代替一抗和二抗。

3.2 盡可能減少客體表面的背景染色

本文已經(jīng)提到引起背景染色的原因主要有兩個(gè)[4]：一是免疫試劑引起手印物質(zhì)擴(kuò)散，二是沖洗時(shí)，未和抗原結(jié)合的功能化的顆粒沒有被沖洗掉，而停留在客體表面上，這主要是因?yàn)樗捎玫娜軇?duì)功能化顆粒的溶解度低所引起的。所以，沖洗時(shí)需要對(duì)洗脫方式和洗脫溶劑進(jìn)行優(yōu)化。

3.3 盡可能地降低非特異性反應(yīng)的效果

對(duì)手印物質(zhì)中的蛋白作為抗原進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，通常先進(jìn)行封阻（blocking），然后在進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，常采用牛血清白蛋白或脫脂奶粉將可能引起吸附的位點(diǎn)進(jìn)行封閉，盡可能地降低非特異性反應(yīng)的效果。

4 展望

針對(duì)汗?jié)撌钟∥镔|(zhì)中的特定成分，采用功能化的顆粒材料（如金納米和磁性顆粒），通過免疫標(biāo)記的方法，顯現(xiàn)出汗?jié)撌钟?，同時(shí)，確定特定成分的存在。與傳統(tǒng)方法相比，免疫標(biāo)記法的亮點(diǎn)在于能深入研究手印物質(zhì)中的某種或某些特殊成分。以此作為依據(jù)，刑偵人員可以推斷嫌疑人接觸過或食用過何種毒品，或者具有哪些生活習(xí)慣，為偵破案件提供方向，縮小偵查范圍。免疫標(biāo)記法與某些傳統(tǒng)方法可以相兼容，所以，可以先采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行顯現(xiàn)汗?jié)撌钟?，然后通過免疫標(biāo)記法確定手印物質(zhì)中是否有某些特定成分，兩種方法共同為同一認(rèn)定提供依據(jù)。該方法還可以對(duì)免疫分析法測定手印物質(zhì)中的某種特定成分的含量提供技術(shù)支持[20]。免疫標(biāo)記法也存在著不足之處，例如，使用的抗體成本相對(duì)較高，操作步驟也比相對(duì)傳統(tǒng)方法復(fù)雜。

國外相關(guān)學(xué)者和科研團(tuán)隊(duì)對(duì)免疫標(biāo)記法已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)的研究，但是已報(bào)到的文獻(xiàn)中，對(duì)不同的免疫標(biāo)記方法適用客體的范圍、出現(xiàn)假陽性結(jié)果、與傳統(tǒng)方法的兼容性、保存時(shí)間和條件的影響等問題依然有待研究。國內(nèi)關(guān)于免疫標(biāo)記法在汗?jié)撌钟〉娘@現(xiàn)與成分檢測的研究比較少[21]，更缺乏系統(tǒng)深入的研究。目前，國內(nèi)關(guān)于功能化的金納米材料的合成、表征和應(yīng)用的研究比較多[22-23]，免疫標(biāo)記法用于顯現(xiàn)汗?jié)撌钟∫约皩?duì)其中特定成分的檢測也逐漸引起相關(guān)學(xué)者的關(guān)注[18，24]。免疫標(biāo)記法能夠在顯現(xiàn)手印的同時(shí)，為刻畫嫌疑人提供依據(jù)，為偵查提供方向，并且具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，將會(huì)在指紋顯現(xiàn)領(lǐng)域發(fā)揮更廣泛的應(yīng)用。

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