冰凍血樣的DNA提取方法比較

黃旭穎 李劍平

（遼寧省沈陽中心血站，遼寧 沈陽 110044）

冰凍血樣的DNA提取方法比較

黃旭穎 李劍平

（遼寧省沈陽中心血站，遼寧 沈陽 110044）

目的 探索冰凍血樣的最佳提取方法，保證DNA檢測(cè)分析的質(zhì)量。方法 采用離心柱法和磁珠法進(jìn)行DNA提取，分析所得DNA的濃度和純度。結(jié)果 兩種DNA提取方法提取DNA純度均符合實(shí)驗(yàn)要求（1.6～1.9），兩種方法無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；磁珠法提取凍存血樣所得DNA濃度高于離心柱法，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 對(duì)于冰凍血液的DNA提取，磁珠法優(yōu)于離心柱法。

冰凍血；DNA提??；方法；比較

從全血中提取基因組DNA是許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。DNA的純度和濃度直接影響HLA分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。不同的檢測(cè)技術(shù)對(duì)DNA材料的量要求不同[1]。中國造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫的HLA基因分型工作所采用的全血血樣，有時(shí)是新鮮血樣提取，絕大多數(shù)都是冰凍血樣。血樣存儲(chǔ)時(shí)間越長，提取出的DNA含量就越低[2]。本實(shí)驗(yàn)室就冰凍血樣采用離心柱法和磁珠法提取基因組DNA，以確定哪種方法更適合冰凍血樣的提取。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本：均來自造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者血樣100份。EDTA抗凝血3～5 mL，-60 ℃冷凍保存3年，DNA提取時(shí)使用全血200 μL。

1.1.2試劑：血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），天根生物技術(shù)科技有限公司生產(chǎn)；血液基因組DNA提取試劑盒（磁珠法），TBG公司生產(chǎn)。

1.1.3儀器：離心柱法使用德國生產(chǎn)的HERMLE Z323高速離心機(jī)和HH?W21?600型電熱恒溫水箱，磁珠法使用Ezbead System-32型提取儀（產(chǎn)地：臺(tái)灣），基因組DNA含量和純度檢測(cè)使用Merinton SMA4000核酸蛋白測(cè)定儀。

1.2方法

1.2.1離心柱法：取血液樣品200 μL，加入20 μL蛋白酶K溶液混勻，加入200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，56 ℃放置10 min，其間顛倒混勻數(shù)次；加200 μL無水乙醇充分顛倒混勻；將所得溶液加入一個(gè)吸附柱中，13400 g離心30 s棄廢液；向吸附柱中加入500 μL緩沖液GD，離心棄廢液；向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW，離心棄廢液；向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW，離心棄廢液；將吸附柱轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加70 μL洗脫緩沖液TB，離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.2.2磁珠法：使用96孔深孔板，在第1及7列加入裂解液800 μL，第2及8列加入洗液1 1000 μL、磁珠80 μL，第3及9列加入洗液1 1000 μL，第4及10列加入洗液2 1000 μL，第5及11列加入洗液2 1000 μL，第6及12列加入洗脫液150 μL；將200 μL全血樣本對(duì)應(yīng)加入標(biāo)識(shí)的深孔板的第1及7列孔中；將反應(yīng)板置于Ezbead System-32中加熱組件滑槽內(nèi)，點(diǎn)擊運(yùn)行程序；程序運(yùn)行結(jié)束后取出反應(yīng)板，將第6及12列的DNA移至潔凈的離心管中。

1.2.3DNA濃度和純度檢測(cè)：SMA4000微量分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，選擇SMA4000模塊，清洗檢測(cè)平臺(tái)，點(diǎn)擊Nucleic Acid程序，2 μL蒸餾水做空白對(duì)照，2 μLDNA進(jìn)行純度（A260nm/A280nm）和濃度（ng/μL)的測(cè)定。

2　結(jié) 果

圖1　兩種方法提取DNA濃度比較

圖2　兩種方法提取DNA純度比較

見表1。用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，磁珠法提取冰凍血樣所得DNA的濃度高于離心柱法，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而磁珠法和離心柱法提取DNA 的純度均符合實(shí)驗(yàn)要求（1.6～1.9），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。具體見圖1和圖2。提取的DNA已用于進(jìn)行HLA基因分型，成功地進(jìn)行了分型。

表1　兩種方法提取DNA濃度和純度的比較

3　討 論

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的DNA提取方法有胍鹽酸法、鹽析法、離心柱法、磁珠法等。核酸純化是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，核酸得率、純度及可重復(fù)性是評(píng)估核酸純化效果的重要指標(biāo)[3]。

離心柱法采用了可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱，提取血液中的基因組DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一吸附DNA，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。使用200 μL血樣提取時(shí)不需要裂解，提取新鮮血樣效果好，已在本室應(yīng)用多年。

磁珠法提取DNA時(shí)，首先對(duì)血樣進(jìn)行了裂解，被裂解的全血中加入磁珠后，磁珠在裂解液的作用下表面的硅離子帶上正電荷，特異性地吸附帶有負(fù)電的核酸，但帶有正電的蛋白質(zhì)和不帶電的其他雜質(zhì)仍然留在溶液中[4]。提取儀程序設(shè)置使磁棒有無磁性以達(dá)到吸附或洗脫磁珠的原理，使吸附到磁珠表面的核酸通過裂解、洗滌以獲得純化的核酸模板。提取儀提取DNA操作簡(jiǎn)便、快速，對(duì)于中國造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫的冰凍血樣，有明顯的優(yōu)勢(shì)。

[1]段瑩，于衛(wèi)建.-40℃條件下儲(chǔ)存不同時(shí)間的全血對(duì)提取DNA濃度的影響[J].中國輸血雜志，2011，24（11)：973-974.

[2]朱建立，李曉天，溫戰(zhàn)迎，等.兩種提取人血凝塊基因組DNA方法的比較[J].山東醫(yī)藥，2013，53（19)：33-35.

[3]王大明，唐斯，鄒紅巖，等.自動(dòng)工作站提取基因組DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2007，22（3)：1-3.

[4]王大明，鄒紅巖，李楨，等.全血反復(fù)凍融對(duì)工作站提取基因組DNA的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2009，24（3)：96-98.

R446.9

B

1671-8194（2015）25-0058-01