左旋丁苯酞對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬β-淀粉樣肽及Tau蛋白磷酸化的影響

羅　超　呂淑英　潘龍瑞　趙萬(wàn)紅▲.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰44000；.湖北十堰鐵鋒醫(yī)院麻醉科，湖北十堰44000

左旋丁苯酞對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬β-淀粉樣肽及Tau蛋白磷酸化的影響

羅超1呂淑英2潘龍瑞1趙萬(wàn)紅1▲
1.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000；2.湖北十堰鐵鋒醫(yī)院麻醉科，湖北十堰442000

目的觀察左旋丁苯酞（L-NBP）對(duì)慢性腦缺血大鼠認(rèn)知的改善作用以及對(duì)海馬β-淀粉樣肽（Aβ1-42）水平以及Tau蛋白磷酸化的影響，探討其作用機(jī)制。方法采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立慢性腦缺血模型，實(shí)驗(yàn)分四組：假手術(shù)組、模型組、L-NBP 30 mg/kg組和L-NBP 120 mg/kg組。假手術(shù)組、模型組予植物油灌胃治療，L-NBP 30mg/kg組和L-NBP 120mg/kg組連續(xù)給予45 d治療，用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)大鼠海馬組織中Aβ1-42的含量；采用免疫印跡法檢測(cè)Tau蛋白的磷酸化水平，HE染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元的形態(tài)。結(jié)果在水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中，L-NBP 30 mg/kg組和L-NBP 120mg/kg組大鼠在目標(biāo)象限時(shí)間百分比分別為（26.3±6.4）%和（28.6±5.8）%，與模型組［（15.2±5.2）%］比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；L-NBP明顯減少了大鼠海馬Aβ1-42含量，L-NBP 30mg/kg組和L-NBP 120mg/kg組分別為（1.07± 0.30）和（0.99±0.18），L-NBP 120mg/kg組與模型組（1.36±0.24）比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；L-NBP 30mg/kg組及L-NBP 120mg/kg組大鼠海馬組織磷酸化Tau蛋白表達(dá)水平［（1.72±0.18）、（1.43±0.35）］較模型組（1.82±0.23）明顯降低，L-NBP120mg/kg組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HE染色觀察到L-NBP可明顯改善海馬神經(jīng)元的形態(tài)異常。結(jié)論L-NBP改善慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶缺陷，是通過(guò)減少海馬Aβ1-42的水平，減輕Tau蛋白的磷酸化，改善海馬神經(jīng)元的形態(tài)異常，保護(hù)了海馬神經(jīng)元。

左旋丁苯酞；β-淀粉樣肽；P-Tau蛋白；海馬

左旋丁苯酞（L-NBP）是丁苯酞光學(xué)異構(gòu)體。在以往研究發(fā)現(xiàn)，3-N-Butylphthalide可以減輕大腦皮質(zhì)B-淀粉樣肽含量水平，改善腦低灌注引起的血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶［1］。但不清楚L-NBP是否與大鼠海馬Tau蛋白的磷酸化和Aβ1-42的表達(dá)水平存在一定的關(guān)聯(lián)。通過(guò)結(jié)扎大鼠兩側(cè)頸總動(dòng)脈制備慢性腦缺血的模型，觀察L-NBP對(duì)其海馬β-淀粉樣肽（Aβ1-42）含量改變、Tau蛋白Ser396位點(diǎn)磷酸化水平改變以及HE染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元的形態(tài)改變上，研究探討L-NBP的主要作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.2模型制備及給藥分組

大鼠手術(shù)前12 h禁食不禁水，麻醉用10%的水合氯醛按300mg/kg腹腔注射。模型組、L-NBP 30mg/kg組、L-NBP 120 mg/kg組游離大鼠兩側(cè)頸總動(dòng)脈并永久性結(jié)扎3個(gè)月，假手術(shù)組游離大鼠兩側(cè)頸總動(dòng)脈后不結(jié)扎，術(shù)后給予青霉素腹腔注射200 kU/d連續(xù)治療3 d。將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、L-NBP 30mg/kg組、L-NBP 120 mg/kg組，每組各6只。假手術(shù)組、模型組給予花生油2 mL/kg灌胃；L-NBP治療兩組把L-NBP溶解于花生油中連續(xù)45 d分別給予30mg/kg組和L-NBP 120mg/kg組灌胃治療。

1.3檢測(cè)大鼠記憶行為能力

結(jié)束灌胃前5 d進(jìn)行定位航行訓(xùn)練，Morris水迷宮監(jiān)測(cè)并記錄大鼠的游泳軌跡。在位航行訓(xùn)練每只大鼠均接受每天2次，間隔10 min訓(xùn)練尋找平臺(tái)。第6天移去平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，讓大鼠尋找平臺(tái)自由游泳60 s記錄4個(gè)象限活動(dòng)的時(shí)間。

1.4測(cè)定大鼠海馬Aβ1-42含量

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭取腦在冰浴上分離海馬，海馬組織勻漿。采用ELISA方法，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，Aβ1-42含量的測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，測(cè)定海馬中Aβ1-42含量。

1.5測(cè)定大鼠海馬磷酸化Tau蛋白表達(dá)水平

取海馬組織勻漿方法同上，采用Western blot方法，對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析用圖像分析軟件，磷酸化Tau蛋白的相對(duì)含量=磷酸化Tau條帶灰度值/內(nèi)參Actin灰度值。

1997年，孟晚舟繼續(xù)研讀學(xué)業(yè)，在華中科技大學(xué)取得會(huì)計(jì)碩士學(xué)位，回到了華為的財(cái)務(wù)部門。根據(jù)華為官網(wǎng)的介紹，此后，孟晚舟建立了全球統(tǒng)一的華為財(cái)務(wù)組織，還歷任華為國(guó)際會(huì)計(jì)部總監(jiān)、華為香港公司首席財(cái)務(wù)官、賬務(wù)管理部總裁。

1.6觀察大鼠腦組織形態(tài)

將大鼠4%多聚甲醛灌流后，取腦，用進(jìn)行固定，然后做石蠟切片，HE染色法對(duì)海馬進(jìn)行HE常規(guī)染色，觀察其CA1區(qū)形態(tài)改變。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 L-NBP對(duì)慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

在Morris水迷宮空間探索第6天實(shí)驗(yàn)中，撤去平臺(tái)后讓大鼠自由游泳60 s尋找平臺(tái)，記錄大鼠游泳軌跡，系統(tǒng)自動(dòng)分析計(jì)算大鼠在平臺(tái)所在象限活動(dòng)時(shí)間。模型組在目標(biāo)象限時(shí)間百分比僅為（15.2±5.2）%，與假手術(shù)組大鼠［（33.5±4.5）%］比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明慢性腦缺血的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力已經(jīng)明顯下降。然而連續(xù)45 d L-NBP治療后，L-NBP 30 mg/kg組和L-NBP 120 mg/kg組大鼠在目標(biāo)象限時(shí)間百分比分別為（26.3±6.4）%和（28.6±5.8）%，與模型組比較，L-NBP 120 mg/kg組大鼠的記憶能力有所改善（P＜0.01）。

2.2慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)變化

HE染色以不同顏色顯示細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，可以清楚地看到細(xì)胞的大體形態(tài)。本研究中海馬CA1區(qū)，與假手術(shù)組比較，模型組可見(jiàn)神經(jīng)元皺縮、深染、核不清晰，但程度略輕。連續(xù)給藥45 d，L-NBP 30mg/kg組輕度改善海馬神經(jīng)元的形態(tài)異常。L-NBP 120mg/kg組明顯改善海馬神經(jīng)元的形態(tài)異常（圖1）。表明該藥對(duì)慢性腦缺血引起海馬神經(jīng)元損傷有保護(hù)和治療作用。

2.3 L-NBP減少了慢性腦缺血大鼠海馬β-淀粉樣肽含量

大鼠慢性腦缺血3個(gè)月后模型組與假手術(shù)組比較海馬Aβ-42含量顯著升高（P＜0.01）。L-NBP 30mg/kg組和L-NBP 120 mg/kg組連續(xù)藥45 d治療后均降低了海馬的Aβ-42含量，L-NBP 120mg/kg組與模型組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示該藥減少了Aβ-42在慢性腦缺血大鼠海馬表達(dá)，且呈一定的劑量依賴性。見(jiàn)表1。

圖1　慢性腦缺血海馬CA1區(qū)神經(jīng)元（HE染色，400×）

表1　各組慢性腦缺血大鼠海馬β-淀粉樣肽含量

2.4 L-NBP對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬Tau蛋白磷酸化水平的影響

大鼠慢性腦缺血3個(gè)月后，模型組大鼠海馬組織Tau蛋白相對(duì)含量（1.82±0.23）較假手術(shù)組（1.23±0.31）顯著升高（P＜0.01）。給藥45 d后，L-NBP 30 mg/kg組及L-NBP120 mg/kg組大鼠海馬組織磷酸化Tau蛋白［（1.72±0.18）、（1.43±0.35）］較模型組明顯降低，L-NBP120 mg/kg組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明在慢性腦缺血后L-NBP能有效降低海馬Tau蛋白磷酸化水平，且呈一定的劑量依賴性。見(jiàn)圖2。

圖2　慢性腦缺血海馬磷酸化Tau蛋白表達(dá)水平

3　討論

隨著年齡增長(zhǎng)，部分老年人會(huì)出現(xiàn)動(dòng)脈硬化狹窄等心血管相關(guān)疾病，使大腦處于持續(xù)低灌狀態(tài)，引起腦毛細(xì)血管血流量降低，最后導(dǎo)致近記憶和空間定向力障礙。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，以長(zhǎng)期的慢性腦供血不足引起血管性癡呆占很高的比例［2-3］。

海馬的CA1區(qū)神經(jīng)元與動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶力密切相關(guān)，缺血CA1區(qū)對(duì)缺血損傷最為敏感，可出現(xiàn)較為嚴(yán)重的神經(jīng)損害［4］。海馬受損后主要是與近期的記憶有關(guān)，并且伴有空間定向障礙，本研究在海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)可以觀察到L-NBP治療組可明顯的改善了因腦缺血引起的大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)異常。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮采用空間探索，發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血大鼠的記憶和空間辨別力明顯降低，在給予L-NBP治療后的兩個(gè)劑量均能不同程度地改善缺陷，并有一定的劑量依賴性。

APP在酶的作用下，形成的多肽片段，Aβ片段通過(guò)積聚、沉淀和纖維化具有毒性，其中Aβ1-42更具有破壞力。Aβ產(chǎn)生、降解和清除是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)表明，大鼠腦缺血后Aβ表達(dá)增多。已有實(shí)驗(yàn)表明在APP突變的轉(zhuǎn)基因鼠Aβ過(guò)度表達(dá)，進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)把Aβ注射入恒河猴的腦皮層，發(fā)現(xiàn)引起了TAU蛋白的磷酸化，也導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡增加［5-6］。Hernandez等［7］研究表明Aβ激活CDK-5途徑通過(guò)糖原合成酶激酶-3（GSK-3），使Tau蛋白過(guò)度磷酸化。Tau蛋白主要是促進(jìn)微管的形成，誘導(dǎo)微管成束，保持其穩(wěn)定性。但TAU蛋白過(guò)度磷酸化后導(dǎo)致微管蛋白結(jié)合降低喪失導(dǎo)致微管解聚崩解，過(guò)度的磷酸化Tau蛋白則自身形成PHF/HFT結(jié)構(gòu)從而發(fā)生神經(jīng)元纖維變性［8-9］，導(dǎo)致微管裂解，神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)不良［10］造成臨床癡呆癥狀。同時(shí)Aβ過(guò)表達(dá)能引起多種神經(jīng)毒性，破壞胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和上調(diào)前凋亡基因bax等［11］。以上各種原因最終導(dǎo)致神經(jīng)元的調(diào)亡，引起臨床患者的癡呆癥狀。這些研究均提示，Aβ量的增加或改變可能是血管性癡呆病理過(guò)程啟動(dòng)因素。在本次實(shí)驗(yàn)中大鼠腦缺血后3個(gè)月，海馬的Aβ產(chǎn)量顯著升高，同時(shí)Tau蛋白磷酸化水平也升高。大劑量的L-NBP給藥45 d后，可以顯著降低海馬的Aβ含量以及Tau蛋白磷酸化水平。這表明L-NBP可以減少了Aβ產(chǎn)量，同時(shí)也降低了Tau蛋白磷酸化水平。因此推測(cè)，L-NBP改善了腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，可以是通過(guò)抑制腦缺血后大鼠海馬Aβ產(chǎn)量，降低TAU蛋白磷酸化，穩(wěn)定了微管蛋白最終了保護(hù)海馬神經(jīng)元損傷。

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Effect of L-3-N-Butylphthalide on the P-Tau protein level andβ-am yloid peptide content in the hippocam pus of cerebral hypoperfused rats

LUOChao1LU Shuying2PAN Longrui1ZHAOWanhong1▲
1.School of Basic Medicine，Hubei University of Medicine，Hubei Province，Shiyan 442000，China；2.Department of Anesthesiology，Tiefeng Hospital，Hubei Province，Shiyan 442000，China

Objective To investigate the protective effects of L-NBP on the cognitive dysfunction andβ-amyloid peptide content and Tau protein phosphorylation on changes and HE staining morphology of hippocampal neurons in the hippocampus of cerebral hypoperfused rats and explore the possiblemolecularmechanism.M ethods Cerebral ischemic ratmodels were induced by ligating the bilateral common carotid arteries.The rats were divided into four groups of sham group，model group，L-NBP 30 mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group.The sham group and model group were administered oil，and L-NBP 30 mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group were with L-NBP for 45 days，and then，the spatial cognition was spatial probe in Morriswatermaze.HE stainingmorphology of hippocampal neurons and theβ-amyloid peptide content and the expression of phosphorylation Tau protein were detected by biochemicalmethod. Resu lts The time spent percentages in the platform-quadrant in L-NBP 30mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group were（26.3±6.4）%and（28.6±5.8）%，compared with L-NBP 120 mg/kg group and themodel group［（15.2±5.2）%］，the differencewas statistically significant（P＜0.01）；the expression of Aβ1-42 was reduced by the L-NBP，the expression of Aβ1-42 in L-NBP 30mg/kg group and L-NBP 120mg/kg group were（1.07±0.30），（0.99±0.18），compared L-NBP 120mg/kg group and themodel group（1.36±0.24），the differencewas statistically significant（P＜0.01）；Tau protein expression level of L-NBP 30 mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group［（1.72±0.18），（1.43±0.35）］were lower than that of themodel group（1.82±0.23），the difference between the L-NBP 120 mg/kg group and the model group was statistically significant（P＜0.05）.L-NBP could significantly improve protected themorphologicalabnormalities in hippocampal neurons.Conclusion L-NBP can improve the damage of cognition and decreaseβ-amyloid peptide content，thereby reduce phosphorylation of Tau protein levels and improvemorphological abnormalities of hippocampalneurons in the hippocampus of cerebral ischemic rats.

L-3-N-Butylphthalide；β-amyloid peptide；P-Tau protein；Hhippocampus

R74

A

1673-7210（2015）05（a）-0011-04

2014-12-02本文編輯：任念）

湖北省教育廳科研項(xiàng)目（D20102101）；湖北醫(yī)藥學(xué)院研究生啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2013QDJZR15）；湖北醫(yī)藥學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（2014XKJSXJ02）。