八角葉多糖的最佳提取工藝研究

鄒修文，楊啟源，盛家榮

(廣西師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，廣西 南寧 530001)

八角是我國珍貴經(jīng)濟樹種，在我國南方地區(qū)具有悠久的栽培和應(yīng)用歷史，廣西是中國乃至全球最大的八角主產(chǎn)區(qū)，其品質(zhì)優(yōu)良，被稱為“世界八角之鄉(xiāng)”[1]。八角又稱“八角茴香”，含豐富的天然活性成分八角茴香油﹑有機酸﹑八角茴香油樹脂﹑黃酮﹑倍半萜內(nèi)酯﹑多糖﹑木脂素類等[2]。八角的研究已成為近年來的研究熱點[3-10]，八角果﹑莖﹑葉中均含有多糖[11-13]，但關(guān)于八角葉多糖的最佳提取工藝研究尚未見報道。做好八角的研究開發(fā)，增加八角的高附加值，對廣西經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。本文以粗多糖提取率為考察指標(biāo)，采用水提醇沉法提取八角葉多糖，通過正交設(shè)計實驗優(yōu)化影響粗多糖產(chǎn)率的主要因素，為八角葉多糖的深入研究與開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑及儀器

原料：八角葉采自廣西壯族自治區(qū)北流市西埌鎮(zhèn)大車村；試劑：D-葡萄糖（化學(xué)純），無水乙醇﹑丙酮﹑苯酚﹑硫酸（均為分析純）。

儀器：DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，ME203E 型電子天平，HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，RV 10 basic 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-B95 型循環(huán)水式多用真空泵，DT5-2 型低速臺式離心機，722S 型可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 正交實驗設(shè)計

設(shè)計L9(34)正交表[14]，選擇提取時間﹑料液比﹑提取溫度和提取次數(shù)4 個因素設(shè)計正交實驗，因素水平表見表1。

表1 八角葉多糖提取因素水平

1.2.2 八角葉多糖的提取

將八角葉清洗干凈﹑烘干﹑粉碎 ，準(zhǔn)確稱取9 份八角葉干粉，每份12.000g，按正交實驗表下的因素水平條件進(jìn)行實驗。水煮至規(guī)定時間后，放冷，離心（4000r·min-1×3min），取上清液，減壓濃縮至20mL，加4 倍體積無水乙醇沉淀多糖，置于冰箱中靜置過夜，抽濾，分別用無水乙醇﹑丙酮洗滌2～3 次，60℃下烘干，得固體粉末，稱重，計算粗多糖提取率。1.2.3 苯酚-硫酸法測定多糖[13]

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確量取苯酚5.000g，用適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL 棕色容量瓶，稀釋至刻度，即得5.0%苯酚溶液。準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖0.025g，加適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，稀釋至刻度，即得100μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取100μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0﹑10.0﹑15.0﹑20.0﹑25.0﹑30.0﹑35.0mL 于7 個50mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得10﹑20﹑30﹑40﹑50﹑60﹑70μg·mL-17 個不同濃度對照品系列溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確移取7 個不同濃度對照品系列溶液1.0mL 于20mL 干燥具塞試管，分別加入1.0mL 5%苯酚溶液，冰水浴條件下再分別加入5.0mL 濃硫酸，搖勻，沸水浴加熱25min，稍冷卻，冰水浴條件下再加入10mL 蒸餾水，待冷卻至室溫，用722S 型可見分光光度計在484nm 處測定其吸光度A。以對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立回歸分析方程。

3）多糖含量的測定：準(zhǔn)確稱取八角葉粗多糖0.011g 于50mL 燒杯，加入1mol·L-1H2SO42 mL，加熱水解2h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶，稀釋至刻度，即得樣品液。準(zhǔn)確量取1.0mL 樣品液3 份置于20mL 干凈具塞試管，分別加入1.0mL 5.0%苯酚溶液，冰水浴條件下再分別加入5.0mL 濃硫酸，搖勻，沸水浴加熱25min，稍冷卻，冰水浴條件下再加入10mL 蒸餾水，待冷卻至室溫，用722S 型可見分光光度計在490nm 處測定其吸光度A。根據(jù)測定結(jié)果和回歸分析方程，計算八角葉中多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實驗

以L9(34)正交表進(jìn)行實驗，選擇提取時間﹑料液比﹑提取溫度和提取次數(shù)等4 個主要影響因素設(shè)計正交實驗，實驗結(jié)果見表2。從表2 極值R 可以看出4 個因素對粗多糖提取率影響的主次順序是D＞A ＞B ＞C，即主要影響因素是提取次數(shù)，其次是提取溫度﹑料液比﹑提取時間，并得出該正交實驗的最佳組合為D2A3B3C2，即提取次數(shù)為2 次，提取溫度為75℃，料液比為1∶50，提取時間為3h。

2.2 驗證實驗

按照最佳工藝條件進(jìn)行3 批驗證實驗，粗多糖提取率分別為13.08%，12.63%，12.89%，其平均值為12.87%，驗證結(jié)果比較穩(wěn)定，與正交設(shè)計實驗最優(yōu)實驗結(jié)果接近。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)1.2.3 所測得的葡萄糖對照品系列濃度的吸光度（表3），對表3 的數(shù)據(jù)用計算機進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程：A=0.06229+0.00864C，R=0.99837，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

表2 正交實驗結(jié)果

表3 葡萄糖對照品系列濃度的吸光度結(jié)果

圖1 葡萄糖對照品系列濃度的吸光度數(shù)據(jù)線性回歸分析

2.4 多糖含量的測定

最佳工藝條件下，八角葉粗多糖提取率為12.87%，根據(jù)1.2.3 所測得的八角葉粗多糖樣品的吸光度結(jié)果見表4。根據(jù)2.3 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及以下公式計算八角葉粗多糖中多糖的含量[15]：

其中：W樣為八角葉粗多糖中多糖的含量，%；100 為所配成樣品溶液的體積；C樣為由回歸方程計算得到的樣品濃度，μg·mL-1；0.91 為多糖的校正系數(shù)[16]；106為單位轉(zhuǎn)換因子；m樣為配成樣品溶液稱取的粗多糖樣品質(zhì)量。

根據(jù)所測得樣品吸光度，代入回歸方程計算得出樣品濃度，進(jìn)而代入以上公式，計算得出八角葉干粉中多糖的含量，結(jié)果列于表4。

表4 樣品的吸光度及多糖含量結(jié)果

3 結(jié)論

采用正交設(shè)計實驗優(yōu)化了水提醇沉法提取八角葉粗多糖的工藝條件，提取八角葉粗多糖的最佳工藝條件為：提取次數(shù)為2 次，提取溫度為75℃，料液比為1∶50，提取時間為3h。在最佳工藝條件下，八角葉粗多糖提取率為12.87%，其多糖含量采用苯酚-硫酸法測定，粗多糖中多糖含量為28.22%。八角葉多糖中還含有蛋白質(zhì)﹑小分子雜質(zhì)等物質(zhì)，需要進(jìn)一步進(jìn)行脫蛋白﹑除小分子雜質(zhì)及過柱等才能得到較純的單一組分，這些還有待于進(jìn)一步深入研究。

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