針對青霉素發(fā)酵過程精細(xì)化控制

張德重

【摘要】青霉素是一種重要的抗生素，主要是通過微生物發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)。生產(chǎn)成本中， 發(fā)酵部分占80%以上。在青霉素發(fā)酵的過程中，影響發(fā)酵生產(chǎn)水平的因素主要為菌種生產(chǎn)能力和控制力度。但由于青霉素是微生物的次級代謝產(chǎn)物， 青霉素發(fā)酵過程是微生物、化學(xué)和工程等學(xué)科的理論和技術(shù)的綜合利用，其生化反應(yīng)過程機(jī)理復(fù)雜， 表現(xiàn)出的動態(tài)行為復(fù)雜多變，控制其發(fā)酵過程必然是比較復(fù)雜的。種子質(zhì)量、溫度、pH值、溶氧、培養(yǎng)基中碳源、氮源、硫源、前提物質(zhì)苯乙酸等因素影響青霉素發(fā)酵，使得青霉素的發(fā)酵過程變得復(fù)雜而難以控制。因此，要想順利的進(jìn)行青霉素發(fā)酵的工作，就要對發(fā)酵過程進(jìn)行精細(xì)化的控制，保障青霉素的整體發(fā)酵水平。本文根據(jù)生產(chǎn)實(shí)踐就青霉素發(fā)酵過程精細(xì)化控制進(jìn)行了簡要的探究。

【關(guān)鍵詞】青霉素；發(fā)酵；精細(xì)化控制

【中圖分類號】TQ465.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0658-01

青霉素發(fā)酵從出現(xiàn)至今已經(jīng)有60余年的歷史，青霉素發(fā)酵水平隨著菌種篩選與改造、自動化水平及工藝控制日漸成熟水平的提高而得到顯著的提高。菌種的生產(chǎn)能力不斷提高是青霉素發(fā)酵水平提高的最主要的因素。然而想要發(fā)揮出菌種的最大生產(chǎn)能力，主要還是在于對發(fā)酵過程的控制，青霉素發(fā)酵過程的控制是在對生產(chǎn)菌的環(huán)境條件和代謝變化參數(shù)測量的基礎(chǔ)上， 結(jié)合代謝調(diào)控的基礎(chǔ)理論進(jìn)行， 使產(chǎn)生菌的代謝變化沿著最佳的軌跡進(jìn)行， 以較低的能量和物料消耗生產(chǎn)更多的青霉素，因此，為了提高青霉素的產(chǎn)量， 降低生產(chǎn)成本，對青霉素發(fā)酵過程進(jìn)行過程進(jìn)行精細(xì)化控制就顯得格外重要。

1.1菌種：點(diǎn)青霉菌（哈藥集團(tuán)制藥總廠生產(chǎn)用菌種）。

1.2設(shè)備：種子罐，15m3；發(fā)酵罐，100 m3。

2主要控制參數(shù)

2.1種子罐：發(fā)酵溫度27±1℃，空氣流量1：0.5～1.0，種子罐周期66—72h。

2.2發(fā)酵罐：發(fā)酵溫度60h前，27℃；60～160h，25℃；160 h后，22～24℃?？諝饬髁?：0.6～1.2，pH值控制在6.45～6.55，發(fā)酵周期200h，發(fā)酵過程中連續(xù)補(bǔ)入葡萄糖、苯乙酸鈉、硫銨、氨水、消沫劑。

3.工藝控制要點(diǎn)

3.1種子質(zhì)量

青霉素種子制備大多采用二級培養(yǎng)，將優(yōu)選好的菌種接種到種子罐中，在一定的溫度和空氣量的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成的大量菌種則送入發(fā)酵罐進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)。青霉素發(fā)酵主要依靠菌種，因此，在進(jìn)行發(fā)酵工藝前，首先要培養(yǎng)種子。在進(jìn)行種子的培養(yǎng)時，要嚴(yán)格按照相關(guān)的培養(yǎng)工藝進(jìn)行種子的繁殖培養(yǎng)，切忌盲目的進(jìn)行培養(yǎng)工作。最大限度的保障培養(yǎng)室內(nèi)的溫度，控制室內(nèi)空氣的水分，保障室內(nèi)空氣的流通量。在種子的培養(yǎng)過程中，要注意對種子中的pH值和菌絲量進(jìn)行實(shí)時的監(jiān)測，并且做好記錄。一般來說，菌絲量主要是對種子生長情況的一種反映，如果菌絲量減少，那么就說明種子的生長情況出現(xiàn)緩慢的趨勢，針對這種情況，可以適當(dāng)?shù)奶岣呤覂?nèi)的溫度數(shù)，并且加大空氣的流通量，從而保障種子的正常生長。如果菌絲量增多，則說明種子的生長過快，種子很容易出現(xiàn)衰老的現(xiàn)象，這樣會嚴(yán)重影響到發(fā)酵的水平，在出現(xiàn)這種狀況時，可以適當(dāng)?shù)慕档褪覂?nèi)的空氣溫度，并且控制通風(fēng)量，這樣能夠有效抑制種子的生長，之所以要對種子的生長狀況進(jìn)行控制，是為了使得保障種子中的PH值和菌絲量趨于穩(wěn)定，從而滿足移種的條件。

3.2溫度控制

青霉菌生長的適宜溫度時30℃，而分泌青霉素的適宜溫度為20℃左右，生產(chǎn)上采用變溫控制法，使之適合不同階段的需求。如采用從27℃逐漸降溫至22℃的發(fā)酵溫度，可延緩菌絲衰老，增加培養(yǎng)液的溶氧濃度，延長發(fā)酵周期，有利于發(fā)酵后期青霉素單位的增長。本文對青霉素分批發(fā)酵進(jìn)行了研究，并以所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：0～60h維持在27℃，60～160h維持在25℃， 160h后根據(jù)青霉素純度，控制22～24℃培養(yǎng)。采用這種變溫培養(yǎng)方法比常溫25℃培養(yǎng)產(chǎn)量增加了12%，且后期采用降溫培養(yǎng)，青霉素純度提高1.5%。

3.3pH值控制

無論是在種子的培養(yǎng)過程中還是在發(fā)酵的過程中，都需要對pH值進(jìn)行有效的控制。這是因?yàn)椋琾H值是發(fā)酵過程主要的參考數(shù)據(jù)，其反映了青霉素發(fā)酵的整體狀況，還能夠?qū)w細(xì)胞的代謝產(chǎn)生直接的影響，對補(bǔ)料量的應(yīng)用是否恰當(dāng)有一個直觀的反映。

在發(fā)酵前期，由于菌體利用玉米漿中蛋白的碳骨架，釋放出較多的堿性分子，所以pH值在發(fā)酵十幾個小時后會出現(xiàn)明顯的上升趨勢。如果這個周期pH值沒有出現(xiàn)上升，或者上升幅度過小，說明發(fā)酵有異常，原因一般有2個：一是前期加糖過量，造成pH值不上返；二是種子質(zhì)量差，生長緩慢。當(dāng)出現(xiàn)這種情況時要通過減少加糖來調(diào)整。當(dāng)開始補(bǔ)氨水時，pH值就受到糖和氨水的雙重影響，糖和氨水的加量有個適當(dāng)?shù)谋壤?，如果補(bǔ)料偏離這個比例過多，就說明發(fā)酵過程有異常，應(yīng)盡快查找原因。

3.4葡萄糖及氨氮的控制

在青霉素分批發(fā)酵過程中，分泌期產(chǎn)生的青霉素約占總量的70%～80%?？梢娞岣咔嗝顾禺a(chǎn)量的關(guān)鍵是縮短菌體生長期、延長青霉素分泌期并保持青霉素生產(chǎn)的最大增長率。因此，不僅要按照產(chǎn)生菌的生理特性選擇合適的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，而且必須根據(jù)發(fā)酵過程中的代謝變化對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行控制，使菌體生長既迅速又不易衰老，且能保持青霉素的最大生產(chǎn)速率。

基質(zhì)是產(chǎn)生菌代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，控制基質(zhì)的種類和數(shù)量是補(bǔ)料控制的手段，其中最主要的是碳源的控制。在青霉素發(fā)酵過程中主要采取流加葡萄糖的方法控制碳源。補(bǔ)糖的數(shù)量應(yīng)該使發(fā)酵液中糖的含量既能維持菌體的正常生理代謝，又能防止青霉素生產(chǎn)能力的衰退。在實(shí)際生產(chǎn)中，對補(bǔ)料的控制是以固定補(bǔ)料濃度的補(bǔ)料速率作為控制手段。在發(fā)酵過程中，要摸索出適合設(shè)備和動力條件的加糖率。糖在青霉素發(fā)酵過程中起著調(diào)控代謝方向的作用，發(fā)酵過程中的參數(shù)以及其他幾種補(bǔ)料都受到加糖量的影響，當(dāng)代謝異常時，最終表現(xiàn)為加糖量的相對過量或不足，所以代謝異常時的調(diào)整也是通過加糖量的調(diào)整來完成。

發(fā)酵初期，菌體在利用葡萄糖的同時也利用來自玉米漿中蛋白質(zhì)的現(xiàn)成碳架，引起培養(yǎng)基中氨氮濃度迅速升高，其后隨著葡萄糖代謝酶的大量合成，菌體轉(zhuǎn)變成利用葡萄糖的代謝產(chǎn)物作碳源，同時大量利用培養(yǎng)基中的氨氮合成菌體蛋白。故培養(yǎng)液中氨氮濃度逐漸降低，需要補(bǔ)加硫酸銨以維持合適的濃度。因此，氨氮峰值和出現(xiàn)周期是菌體碳氮代謝與培養(yǎng)基中碳氮濃度的動態(tài)平衡，反映了玉米漿中有機(jī)氮源的利用情況和可利用程度圈。當(dāng)氨氮開始大幅度下降時，這時的菌絲也開始出現(xiàn)斷裂，開始進(jìn)入次級代謝過程，氨氮下降至0.3mg/mL時，開始補(bǔ)入硫酸銨，如果pH值已經(jīng)降至6.5左右，同時也要加入氨水，硫酸銨和氨水都會使氨氮升高。應(yīng)控制氨氮在0.2mg/mL，尤其是在氨氮剛剛降下來時，一定不能使氨氮過高。如果氨氮過高就會使菌絲重新回到初級代謝，則影響次級代謝。在發(fā)酵過程中也不能使氨氮過低，如果氨氮長時間控制在0.1mg/mL以下，就會使碳氮比例失衡，菌體由于缺乏氮源而代謝異常，從而影響到發(fā)酵水平。

3.5苯乙酸的控制

苯乙酸作為青霉素G的側(cè)鏈前體。為了避免前提加入濃度過大而對菌體有毒害，除基礎(chǔ)料加入0.07%的苯乙酸外，發(fā)酵至30小時后按需流加補(bǔ)入苯乙酸，維持發(fā)酵液中苯乙酸濃度在0.1%為宜。 在堿性條件下，苯乙酸被菌體氧化的速度隨培養(yǎng)基的pH上升而增加。年幼的菌絲不氧化前體，而僅用它來構(gòu)成青霉素分子。隨菌齡的增長，氧化能力逐漸增加。培養(yǎng)及成分對前體的氧化程度有較大影響，合成培養(yǎng)基比復(fù)合培養(yǎng)基對前體的氧化量少。在搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通氣條件差的情況下，微生物氧化前體的能力顯著降低。為了減少苯乙酸的氧化，在生產(chǎn)上多用間歇或連續(xù)添加低濃度苯乙酸的方法，以保持前體的供應(yīng)速率僅略大于生物合成的需要。

4結(jié)語

綜上所述，青霉素發(fā)酵工藝經(jīng)過60多年的發(fā)展，基本已經(jīng)成熟，但在細(xì)節(jié)方面仍在不斷完善和改進(jìn)。首先就是要擁有發(fā)酵條件精細(xì)控制，其次要對補(bǔ)料進(jìn)行動態(tài)調(diào)整，將發(fā)酵過程中的各個參數(shù)控制在合理的范圍之內(nèi)，使得發(fā)酵的菌種能夠發(fā)揮出最大的生產(chǎn)力，從而增加單位效價，提高發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本。

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