蜂膠提取液對(duì)草菇及其污染菌抑制作用的研究

曹紅剛，范家恒，李亮梅，趙風(fēng)云

（昆明理工大學(xué)食品工程研究中心，云南昆明650500）

草菇（Volvariella volvacea）又名稻草菇，國(guó)際上稱之為“中國(guó)蘑菇”，在熱帶和亞熱帶地區(qū)被廣泛栽培[1]。草菇子實(shí)體味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[2-3]。草菇在菌種保藏和栽培過(guò)程中，通常使用化學(xué)藥物，如抗生素、甲醛、多菌靈等化學(xué)藥物控制其他微生物的污染[4]，這些化學(xué)藥物在抑制雜菌的同時(shí)，不免進(jìn)入草菇子實(shí)體中，從而影響草菇的食用安全。蜂膠作為一種天然、無(wú)毒的廣譜抗菌劑，若將其代替化學(xué)藥物抑制草菇在菌種保藏和生產(chǎn)過(guò)程中的污染，可在一定程度上增強(qiáng)草菇的食用安全性。

蜂膠是西方蜜蜂（Apismellifera）采集植物樹(shù)脂，并混入蜂蠟、花粉及蜜蜂腺體分泌物后經(jīng)蜜蜂咀嚼加工而成的一種粘稠物質(zhì)[5]。蜜蜂利用蜂膠填補(bǔ)蜂巢空隙，光滑蜂巢內(nèi)壁，并利用蜂膠防止巢房?jī)?nèi)異物的腐爛和病菌的傳染等[6]。黃酮類化合物是蜂膠中的重要生物學(xué)活性物質(zhì)[5]。研究發(fā)現(xiàn)蜂膠的抑菌活性[7]、殺蟲(chóng)性[8]、抗氧化活性[9]等藥理學(xué)活性與其中的黃酮類化合物有密切關(guān)系，因此黃酮類化合物的含量常作為蜂膠質(zhì)量控制的一個(gè)重要的指標(biāo)[10]。

Sawaya等發(fā)現(xiàn)不同提取方法和提取溶劑獲得的蜂膠，其化學(xué)成分存在差異，其抑菌活性各自不同[11]。由于黃酮類化合物多為脂溶性，本實(shí)驗(yàn)采用75%的乙醇、95%的乙醇、75%的乙酸乙酯、95%的乙酸乙酯提取蜂膠中的活性成分，并對(duì)草菇及其污染菌進(jìn)行抑制作用研究。以期得出蜂膠的提取方法、提取液濃度等因素對(duì)草菇及污染菌的抑制作用影響。作為一種天然抑菌劑，蜂膠已被用于果蔬、肉制品、乳品、雞蛋等食品的防腐保鮮[12-14]，然而，可否添加于草菇菌種和栽培生產(chǎn)中，延長(zhǎng)菌種保藏，抑制雜菌污染，尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究可為蜂膠的廣泛應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草菇V23 本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；粗蜂膠 采自云南蒙自；馬鈴薯綜合培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA） 馬鈴薯20%，葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，瓊脂2%，pH自然；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（beef-protein agar medium，BPA） 牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉1.5%，瓊脂2%，pH自然。

AL204電子分析天平 中國(guó)梅特勒-托利多（上海）有限公司；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津公司；ES-315高壓滅菌鍋日本TOMY KOGYO公司；KQ-500DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 蜂膠提取工藝

1.2.1 蜂膠的提取 稱取適量粗蜂膠，置于-20℃下24h后，取出磨碎，稱取磨碎后的蜂膠10g，分別用40m L 75%的乙醇、95%的乙醇、75%的乙酸乙酯、95%的乙酸乙酯，在40℃下浸48h，離心取上清液，-2℃下保存待用。濾渣洗滌、干燥并稱重，計(jì)算可溶物含量和蜂膠提取液濃度。

蜂膠提取液濃度（mg/m L）=蜂膠總量（mg）×可溶物含量（%）/液總體積（m L）×100

1.2.2 黃酮含量的測(cè)定 蜂膠總黃酮含量的測(cè)定[15]：取蜂膠提取液1m L，加入1m L 5%NaNO3溶液，1m L 10%A l（NO3）3溶液，10m L 4.3%NaOH溶液，定容至25m L，搖勻，靜置15m in，于517nm下測(cè)吸光值。以蘆丁為標(biāo)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 草菇菌種污染菌的分離與初步鑒定

1.3.1 細(xì)菌 取草菇污染菌種接種于BPA平板，37℃培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑去少許細(xì)菌劃線分離，培養(yǎng)出單菌落，通過(guò)菌落大小、形態(tài)、色澤及染色、鏡檢進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.2 霉菌 取草菇污染菌種接種于PDA平板，28℃培養(yǎng)1～2d，因污染菌生長(zhǎng)速度大于草菇，從霉菌菌絲末端切取新生菌絲接種于新PDA平板上，培養(yǎng)1～2d，通過(guò)菌落大小、形態(tài)、表面特征、菌絲色澤及染色、鏡檢進(jìn)行菌種鑒定。

1.4 蜂膠提取液對(duì)草菇、霉菌及細(xì)菌的抑制作用

將4種蜂膠提取液用蒸餾水分別稀釋20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、400倍，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，收集濾液進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法為：

1.4.1 草菇、霉菌 吸取1m L蜂膠稀釋液用無(wú)菌L棒涂布于PDA平板，接種活化后的草菇或青霉菌，28℃恒溫培養(yǎng)，對(duì)照組為相應(yīng)的含有相同量的乙酸乙酯水或乙醇水，72h后測(cè)定菌落直徑，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)平行，計(jì)算抑制率。

1.4.2 細(xì)菌 制備濃度為1×106CFU的細(xì)菌菌懸液，涂布于BPA平板上，37℃恒溫培養(yǎng)，待其長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后，取直徑約為6mm的菌塊，接種至涂布有蜂膠稀釋液的BPA平板上，對(duì)照組為相應(yīng)的含有相同量的乙酸乙酯水或乙醇水，48h后測(cè)定抑菌圈直徑，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)平行，計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=[對(duì)照組菌落直徑（mm）-實(shí)驗(yàn)組菌落直徑（mm）]/對(duì)照組菌落直徑（mm）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度乙醇和乙酸乙酯對(duì)蜂膠可溶物和黃酮含量的影響

本實(shí)驗(yàn)采用75%乙醇、95%乙醇、75%乙酸乙酯、95%乙酸乙酯浸提粗蜂膠，測(cè)定其可溶物含量、黃酮含量。以蘆丁作為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程為y=10.95x-0.0042，R2=0.9997，依據(jù)此方程可求出黃酮含量。結(jié)果如表1所示，95%乙酸乙酯提取的蜂膠可溶物含量為60.3%，黃酮含量為6.23mg/m L，均顯著高于其他3個(gè)溶劑（p＜0.05），而75%和95%的乙醇提取液的可溶物含量和黃酮含量之間的差異不顯著（p＞0.05）。

黃酮類化合物是蜂膠中重要的活性成分，其種類繁多，結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同，在不同溶劑中的溶解性也不同。Vardar-Unlu G等認(rèn)為提取溶劑的選擇蜂膠提取物的成分有重要影響[16]。本實(shí)驗(yàn)中相同濃度的乙酸乙酯與乙醇，乙酸乙酯的提取效果優(yōu)于乙醇提取效果，根據(jù)相似相溶原理，可初步推斷云南蒙自蜂膠中含有較多極性較弱的黃酮類化合物。

表1 乙醇與乙酸乙酯的蜂膠提取成分對(duì)比Table1 Comparison of propolis extractby ethanol and ethyl acetate

本實(shí)驗(yàn)中提取的蜂膠液中黃酮含量為4.92～6.23mg/m L。胡福良等[17]、唐坤等[18]提取市售商品蜂膠中黃酮，其含量分別為51.4mg/m L和41.61mg/g，顯著高于本實(shí)驗(yàn)的黃酮含量。其原因可能是：本實(shí)驗(yàn)采用的原料是采自云南蒙自蜂場(chǎng)的未加工的粗蜂膠，含有較多的蜂蠟等雜質(zhì)，可溶物含量?jī)H為48.1%～60.3%，使得提取液中的黃酮類化合物的含量偏低；蜂膠提取液中的黃酮類化合物的種類、含量與蜂膠來(lái)源、提取試劑、測(cè)定方法等因素有關(guān)，也會(huì)造成不同實(shí)驗(yàn)的測(cè)定數(shù)據(jù)有一定的差異性。

2.2 草菇污染菌的初步鑒定結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌的形態(tài)特征 37℃培養(yǎng)24h，菌落直徑為1～5mm，乳白色，不透明，邊緣不規(guī)則，表面干燥粗糙、無(wú)隆起；經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，菌體呈陽(yáng)性，短桿狀。

對(duì)該細(xì)菌的菌落特征和顯微特征初步鑒定為革蘭氏陽(yáng)性桿菌。

2.2.2 霉菌形態(tài)特征 28℃培養(yǎng)2d，菌落直徑為0.5～ 1cm，剛長(zhǎng)出菌落為淡黃色，隨菌落生長(zhǎng)，中心出現(xiàn)墨綠色并向上突起，擴(kuò)展過(guò)程中菌落邊緣有一圈白色菌絲；正反顏色不同，背面為淺黃色；菌落生長(zhǎng)致密、不透明、干燥；隨菌落生長(zhǎng)，白色菌絲消失，最終為墨綠色。

對(duì)菌株進(jìn)行染色、制片，顯微鏡檢特征為菌絲無(wú)色，分生孢子梗單枝，較長(zhǎng)，無(wú)足細(xì)胞，有橫膈膜；孢子梗頂端不膨大，排列成帚狀的間枝，分支1次或2次，對(duì)稱，頂層為小梗，上生分生孢子串，分生孢子串呈不分枝的鏈狀；帚狀枝較短，排列緊密。單個(gè)分生孢子為球形或橢圓形，紫紅色。

對(duì)該霉菌的菌落特征和顯微特征初步鑒定為叢梗孢科（Moniliaceae），青霉屬（Penicillium）。

2.3 蜂膠提取液對(duì)草菇及其污染菌的抑菌作用

將4種蜂膠提取液用蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋，得到稀釋液的蜂膠提取液濃度如表2所示。

表2 4種蜂膠在不同稀釋度下的蜂膠提取液濃度（mg/mL）Table2 The concentration of 4 kinds of propolis extraction in different dilutions（mg/mL）

圖1 75%乙醇提取液對(duì)草菇、霉菌、細(xì)菌的抑制曲線Fig.1 Inhibition curve of propolis extract by 75%ethanol on V.volvacea，bacteria andmould

由圖1～圖4可知，蜂膠提取液對(duì)草菇、霉菌和細(xì)菌的抑制作用趨勢(shì)相似，隨著稀釋倍數(shù)的增加，蜂膠提取液對(duì)草菇、霉菌、細(xì)菌的抑制作用逐漸減弱；相同濃度的蜂膠液對(duì)草菇、霉菌及細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)榧?xì)菌＞草菇＞霉菌。進(jìn)一步比較4種蜂膠提取液的抑菌作用發(fā)現(xiàn)，95%乙酸乙酯蜂膠提取液抑菌效果較優(yōu)。由圖4可知，蜂膠液在60倍（2.5mg/m L）的稀釋度下，對(duì)細(xì)菌的抑制率為100%（致死）；在20倍（7.5mg/m L）的稀釋度下，對(duì)草菇是致死的；蜂膠提取液原液對(duì)霉菌的抑制率為72.83%，高于其他3種提取液的抑制效果（p＞0.05）。

圖2 95%乙醇提取液對(duì)草菇、霉菌、細(xì)菌的抑制曲線Fig.2 Inhibition curve of propolis extract by 95%ethanol on V.volvacea，bacteria andmould

圖3 75%乙酸乙酯提取液對(duì)草菇、霉菌、細(xì)菌的抑制曲線Fig.3 Inhibition curve of propolis extractby 75%ethyl acetate on V.volvacea，bacteria and mould

圖4 95%乙酸乙酯提取液對(duì)草菇、霉菌、細(xì)菌的抑制曲線Fig.4 Inhibition curve of propolis extractby 95%ethyl acetate on V.volvacea，bacteria and mould

抑菌實(shí)驗(yàn)表明，相同濃度的蜂膠浸提液對(duì)草菇及污染菌的抑制作用不同，其抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)榧?xì)菌＞草菇＞霉菌，因此在草菇的栽培過(guò)程中，添加適量的蜂膠提取液可有效抑制細(xì)菌的污染，但對(duì)控制霉菌的污染效果不夠顯著。這與楊艷彬等[19]的研究結(jié)果一致，蜂膠提取液對(duì)細(xì)菌的抑制作用更明顯。

2.4 黃酮含量與抑菌作用的相關(guān)性分析

對(duì)蜂膠提取液中的黃酮含量和草菇及污染菌的抑菌作用進(jìn)行相關(guān)性分析。由表3可知，草菇、霉菌和細(xì)菌的抑制率與黃酮含量的相關(guān)系數(shù)均大于0.9，說(shuō)明黃酮含量和抑菌效果有較強(qiáng)的相關(guān)性，黃酮含量越高，抑菌效果越強(qiáng)；與Pepeljnjak等得出的蜂膠抗菌效果和蜂膠中黃酮類物質(zhì)含量成正比的結(jié)論一致[20]。也進(jìn)一步驗(yàn)證了黃酮類物質(zhì)是一種重要的抗菌活性成分。

表3 蜂膠提取液中黃酮含量與抑菌作用的相關(guān)性分析Table3 Correlations analysis between antimicrobial effectand flavonoid content

3 結(jié)論

本研究以云南蒙自的粗蜂膠為材料，采用75%乙醇、95%乙醇、75%乙酸乙酯、95%乙酸乙酯浸提，測(cè)定蜂膠提取液的黃酮含量，并進(jìn)行草菇及分離獲得的污染菌的抑制作用研究。結(jié)果表明：分離獲得的草菇污染菌初步鑒定為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和青霉屬菌。95%乙酸乙酯提取效果優(yōu)于其他三種溶劑（p＜0.05），4種蜂膠提取液對(duì)草菇及污染菌均有一定的抑制作用，抑制強(qiáng)弱為細(xì)菌＞草菇＞霉菌。相關(guān)性分析表明，草菇、霉菌和細(xì)菌的抑制率與黃酮含量的相關(guān)系數(shù)均大于0.9，有較強(qiáng)的相關(guān)性。本研究表明，蜂膠提取液可以有效抑制草菇的生長(zhǎng)速度，添加適量蜂膠液能適當(dāng)延緩草菇菌種的退化速度。同時(shí)，將適量的蜂膠提取液代替合成的抗生素、殺菌劑等，應(yīng)用于草菇的栽培生產(chǎn)、子實(shí)體保鮮及菌種保藏中，可有效抑制細(xì)菌污染，有一定的應(yīng)用意義。

[1]Chang S T.Biology and cultivation technology of Volvariella volvacea[M].Hong Kong：The Chinese University Press，1993：73-83.

[2]Hsu H C，Hsu C I，Lin R H，et al.Fip-vvo，a new fungal immunomodulatory protein isolated from Volvariella volvacea[J].Biochemical Journal，1997，323（Part2）：557-565.

[3]She Q B，Ng T B，Liu W K.A novel lectin with potent immunomodulatory activity isolated from both fruiting bodies and cultured mycelia of the ediblemushroom Volvariella volvace a[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1998，247（1）：106-111.

[4]陳貴省.草菇雜菌污染的綜合防治[J].植保技術(shù)與推廣，2003，23（1）：16-17.

[5]Bankova V S，de Castro SL，MarcucciM C.Propolis：recent advances in chemistry and plant origin[J].Apidologie，2000，31（1）：3-15.

[6]Kismet K，Kilicoglu B，Koru O，et al.Evaluation on scolicidal efficacy of propolis[J].European Surgical Research，2006，38（5）：476-481.

[7]Popova M，Silici S，Kaftanoglu O，et al.Antibacterial activity of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical composition[J].Phytomedicine，2005，12（3）：221-228.

[8]Prytzyk E，Dantas A P，Salomao K，et al.Flavonoids and trypanocidal activity of Bulgarian propolis[J].Journal of Ethnopharmacology，2003，88（2-3）：189-193.

[9]Lima B，Tapia A，Luna L，et al.Main flavonoids，DPPH activity，andmetal contentallow determination of the geographical origin of propolis from the province of san juan（Argentina）[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（7）：2691-2698.

[10]Sha N，Guan S H，Lu Z Q，et al.Cytotoxic constituents of chinese propolis[J].Journal of Natural Products，2009，72（4）：799-801.

[11]Sawaya A，Souza K S，Marcucci M C，et al.Analysis of the composition of Brazilian propolis extracts by chromatography and evaluation of their in vitro activity against Gram-positive bacteria[J].Brazilian Journal of Microbiology，2004，35（1-2）：104-109.

[12]倪輝，楊遠(yuǎn)帆.蜂膠對(duì)雞蛋保鮮作用的研究[J].食品工業(yè)科技，2001，22（4）：12-14.

[13]魏強(qiáng)華，張娜萍，陳業(yè)，等.蜂膠涂膜劑在番茄保鮮中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2009，30（2）：278-280.

[14]盧兆蕓.蜂膠保鮮機(jī)理及其在食品保鮮中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2008，29（9）：305-308.

[15]余晶晶，董群義.超聲波協(xié)同萃取蜂膠中黃酮類物質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（4）：314-317.

[16]Vardar-Unlu G，Silici S，Unlu M.Composition and in vitro antimicrobial activity of Populus buds and poplar-type propolis [J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24（7）：1011-1017.

[17]胡福良，李英華，朱威，等.不同方法提取的蜂膠液中總黃酮含量的測(cè)定及抗腫瘤與抗炎作用研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2005，5（3）：11-15.

[18]唐坤，李標(biāo)，蔡應(yīng)繁，等.微波-超聲波提取蜂膠的工藝研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29（10）：74-77.

[19]楊艷彬，翟勝江，李登華，等.蜂膠抑菌防腐作用的研究及在王漿蜜生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，1999，20（1）：23-24.

[20]Pepeljnjak S，Kosalec I.Galangin expresses bactericidal activity againstmultiple-resistant bacteria：MRSA，Enterococcus spp.and Pseudomonas aeruginosa[J].Fems Microbiology Letters，2004，240（1）：111-116.