有機(jī)多肽藥物合成方法的研究進(jìn)展

于妹燕等

【摘要】 多肽藥物的主要特點(diǎn)是生物活性高、藥用劑量小、副作用低、產(chǎn)業(yè)化開發(fā)優(yōu)勢明顯等， 現(xiàn)在多肽藥物合成已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)之一. 多肽的化學(xué)合成是在近40年里發(fā)展起來的經(jīng)典的合成方法。本文對多肽合成方法的最新進(jìn)展，特別是對固相方法合成多肽、液相方法合成多肽以及新型多肽藥物合成技術(shù)在多肽合成中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】有機(jī)合成；多肽藥物；研究進(jìn)展；合成方法

【中圖分類號】R969.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0377-02

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金（bsjj201301）

1.引言

我們在自然界中可以看到各種各樣的活性多肽，它們具有自己特有的生物功能。這些種類繁多的多肽，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來看，都是氨基酸的單體組成的。生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì)就是人們說的多肽，多肽是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，它也是蛋白質(zhì)水解之后的中間體，多肽的分子結(jié)構(gòu)是介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的化合物，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而產(chǎn)生的有機(jī)化合物。多肽是作為抗菌物質(zhì)和生物的信號分子在自然界中被發(fā)現(xiàn)的，其多樣的功能醫(yī)藥品原料和機(jī)能性食品等廣泛領(lǐng)域的用途開發(fā)被推進(jìn)。多肽是生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能必需的生物活性化合物，是人體的重要組成物質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)，它廣泛分布于人體各處，特別是大腦里，對幾乎所有的細(xì)胞功能都有調(diào)節(jié)作用，常常被應(yīng)用于功能分析、抗體研究、尤其是藥物研發(fā)等領(lǐng)域。人體如果缺失了多肽，免疫系統(tǒng)、各功能系統(tǒng)就會發(fā)生紊亂，就會出現(xiàn)各種慢性病。為了得到具有特定排列順序的合成多肽，采用任意的合成方法是行不通的，而只能采用逐步縮合的合成方法。[1-2]

1963年多肽合成技術(shù)方面Merrifield研發(fā)與發(fā)展了固相多肽合成方法，而且把固相合成法成功的應(yīng)用在多肽與有機(jī)合成中，固相合成法經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善，現(xiàn)在固相法已成為多肽與預(yù)計(jì)合成的一個(gè)常用與成熟的合成技術(shù)，它表現(xiàn)出了多肽液相合成法無法相比的優(yōu)點(diǎn)，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。多肽合成方法總的來說有兩種：液相多肽合成法和固相多肽合成法。1963年，Merrifield首次發(fā)展了固相多肽合成方法（SPPS），由于其合成中方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且?guī)砹硕嚯挠袡C(jī)合成上的一次革命，并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科——固相有機(jī)合成，固相合成的發(fā)明同時(shí)促進(jìn)了肽合成的自動化。世界上第一臺真正意義上的多肽合成儀出現(xiàn)在1980年代初期。逐步固相多肽合成能合成5-50aa的多肽，對于大于200aa的多肽，通過片段濃縮及連接技術(shù)來合成。下面介紹傳統(tǒng)的兩種多肽合成方法。[3-4]

1.1 固相多肽合成

固相多肽合成方法現(xiàn)在使用的主要有兩種：BOC（叔丁氧羰基）和FMOC（9-芴甲基氧羰基）兩種。BOC方法合成多肽過程中，需要反復(fù)使用TAF（三氟乙酸）脫去BOC，而且在最后從固體上切割下來時(shí)需要使用HF（氫氟酸），由于HF有極強(qiáng)的腐蝕性和劇毒，所以必須使用專門的儀器進(jìn)行操作，而且切割過程中容易產(chǎn)生副反應(yīng)，因此使用時(shí)受到實(shí)驗(yàn)條件限制，現(xiàn)在使用也逐漸減少。FMOC方法合成多肽反應(yīng)條件溫和，在一般的實(shí)驗(yàn)條件下就可以進(jìn)行合成，因此，也得到了非常廣泛的應(yīng)用。多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度。最后脫去保護(hù)基X，用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽。

固相合成的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在最初的反應(yīng)物和產(chǎn)物都是連接在固相載體上，因此可以在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行所有的反應(yīng)，便于自動化操作，加入過量的反應(yīng)物可以獲得高產(chǎn)率的產(chǎn)物，同時(shí)產(chǎn)物很容易分離。

1.2 液相多肽合成

液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)模大，合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn)，而且由于是在均相中進(jìn)行反應(yīng)，可以選擇的反應(yīng)條件更加豐富，像一些催化氫化，堿性水解等條件，都可以使用，這在固相中，使用卻由于反應(yīng)效率低，以及副反應(yīng)等原因，無法應(yīng)用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應(yīng)策略。液相多肽合成法是末端氨基酸依次一個(gè)一個(gè)跟氨基酸縮合，先讓數(shù)個(gè)片段分縮合，后每個(gè)片段縮合法，液相合成法操作效率高等優(yōu)點(diǎn)。

1.3 新型合成技術(shù)

多肽的化學(xué)合成技術(shù)無論是液相合成法還是固相合成法都已成熟。它們都有各自的優(yōu)點(diǎn)和弱點(diǎn)，若果能把固相合成法的分離純化的簡便性和液相合成法的良好的反應(yīng)性相結(jié)合的新型多肽合成法被研發(fā)的話對多肽藥物合成來說能稱為新的突破點(diǎn)?，F(xiàn)在這種新型合成法不斷被研發(fā)，發(fā)展了許多新方法。如疏水性標(biāo)記物，化學(xué)修飾及綠色合成等在研究有機(jī)多肽藥物液相合成中的應(yīng)用等方法，應(yīng)用這種新型合成法，合成以往的方法合成較為困難的多肽。[5-7]

2. 多肽合成的研究歷史

多肽合成研究已經(jīng)走過了一百多年的光輝歷程，1871年夏爾（Schaal）曾經(jīng)用天冬氨酸聚合得到多聚產(chǎn)物，但當(dāng)初沒合成特定排列順序的多肽，本世紀(jì)初才由愛米爾·費(fèi)歇爾（Emil Fischer）開始合成了具有特定順序的多肽的合成。1902年，Emil Fischer首先開始關(guān)注與研發(fā)多肽合成，由于當(dāng)時(shí)在多肽合成方面的知識與報(bào)道太少，科研與進(jìn)展也相當(dāng)?shù)木徛?，直?932年，貝爾格曼（Max Bergmann）等人開始使用多肽合成中Z（芐氧羰基）來保護(hù)α-氨基，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展與改善。到了20世紀(jì)50年代，很多有機(jī)化學(xué)家們合成了大量的具有生物活性多肽，包括胰島素，催產(chǎn)素等，同時(shí)在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績，這些為后來的多肽固相合成方法的出現(xiàn)提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1963年，Merrifield首次提出了多肽固相合成方法（SPPS），這個(gè)在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出現(xiàn)就由于其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且?guī)砹硕嚯挠袡C(jī)合成上的一次革命，并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科——固相有機(jī)合成（SPOS），為此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。Merrifield經(jīng)過了反復(fù)的篩選與改善，累積了一些合成方法最終屏棄了Z（芐氧羰基）在固相上的使用，首先將BOC（叔丁氧羰基）用于保護(hù)α-氨基并在固相多肽合成上使用，同時(shí)，Merrifield在60年代末發(fā)明了第一臺全自動多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124個(gè)氨基酸）。1972，首先Lou Carpino 將FMOC（9-芴甲氧羰基）用于保護(hù)α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除FMOC，數(shù)分鐘就可以反應(yīng)完全，而且由于其反應(yīng)條件溫和，可選擇的反應(yīng)條件更加豐富，在一般的實(shí)驗(yàn)條件下就可以進(jìn)行合成，迅速得到廣泛的使用，代表性的保護(hù)基BOC和FMOC方法為基礎(chǔ)的各種肽自動合成儀也陸續(xù)被出現(xiàn)和發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善。同時(shí)，固相合成樹脂，標(biāo)記物，多肽縮合試劑，原料以及氨基酸保護(hù)基，包括合成環(huán)肽的氨基酸保護(hù)上也取得了較好的成果。同時(shí)，在多肽合成方法上也有了不少新的發(fā)展與改善，無論在氨基酸的選擇，縮合劑，保護(hù)基，溶劑的選擇，反應(yīng)條件以及生成物的分離純化等方面都有新的改進(jìn)和新的發(fā)現(xiàn)。[8-9]

3. 多肽合成的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀

到現(xiàn)在，人們已經(jīng)在人體和生物體中發(fā)現(xiàn)和分離出幾百多種多肽類化合物，關(guān)于多肽藥物的研究與應(yīng)用，也取得了巨大的改善與進(jìn)步，引發(fā)了未來的多肽藥物研究熱潮。多肽藥物的合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價(jià)值，多肽藥物的研究成為了醫(yī)學(xué)，應(yīng)用生命科學(xué)及分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)對象，世界各國家無不撥出巨款來建立各種規(guī)模的研究團(tuán)隊(duì)及多肽研究中心，以期在這一重要領(lǐng)域中取得突破性進(jìn)展。現(xiàn)在已經(jīng)知道，一些活性多肽也在不同程度上存在著像蛋白質(zhì)中的那種螺旋和折疊，但由于活性多肽的肽鏈較短，次級鍵的作用力也較弱，因而高級結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)一般是不完全的，而且構(gòu)象的穩(wěn)定性也較差，在溶液中很容易松散而變成隨意的結(jié)構(gòu)。只有當(dāng)肽鏈的氨基酸數(shù)目增大到一定的程度以后，才有可能具備高級結(jié)構(gòu)所需要的足夠的次級鍵作用力而產(chǎn)生蛋白質(zhì)特有的穩(wěn)定高級結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在具有生物活性的多肽已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在臨床檢測、如多肽藥物在醫(yī)學(xué)研究、醫(yī)藥品的探索，疾病防治和治療及抗體的調(diào)制等，還有多肽食品，多肽化妝品等領(lǐng)域?；钚噪呐c生物的發(fā)育、生長代謝、免疫、疾病、學(xué)習(xí)、記憶和衰老都有極其密切的關(guān)系，因而引起了各國科學(xué)家包括有機(jī)化學(xué)家、生物化學(xué)家、藥物化學(xué)家、結(jié)構(gòu)化學(xué)家等與生命科學(xué)有關(guān)的科學(xué)家的高度重視。[10-11]

4.存在的問題

現(xiàn)在，肽合成法的主流形成的方法是根據(jù)Merrifield確立了固相合成法。這個(gè)方法是聚苯乙烯為首的各種各樣的固相載體（珠）的表面上氨基酸依次結(jié)合，固體上肽鏈合成后，在最后階段的固體表面上從開場白目的物得到的合成法。載體是溶媒惰性，因?yàn)榉磻?yīng)試劑不是溶劑清洗就可以徹底消除，柱分離必要不可缺少的傳統(tǒng)的液相合成法比較分離精制非常簡便。因此，固相合成法是許多的研究者而被辦理，飛躍的進(jìn)化了。

近年來，可是，這樣的優(yōu)秀的應(yīng)用的例子被開發(fā)了的反面，固相合成法相比液相合成法的話反應(yīng)性低，收益低的情況，很難規(guī)模，固相合成法有這樣的特別的缺點(diǎn)也存在。在液相多肽合成中，每次接肽以后都需要對產(chǎn)物的分離純化或結(jié)晶以便除去未反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物。這個(gè)步驟相當(dāng)費(fèi)時(shí)間而且麻煩，因操作帶來的損失往往也很大。[12-13]

5. 展望

多肽藥物具有生物活性高、藥用劑量小、但是其代謝不穩(wěn)定、半衰期短及較難通透組織屏障等缺點(diǎn)嚴(yán)重阻礙了多肽新藥在臨床治療中的廣泛應(yīng)用.本綜述中說的新型合成法被研發(fā)的話，通過這些新型合成法的應(yīng)用，以期加快多肽藥物的合成及臨床應(yīng)用的步伐.

目前，多肽藥物的特點(diǎn)具有藥用劑量小、副作用低、生理活性高、易于進(jìn)入應(yīng)用等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。同時(shí)，多肽藥物生產(chǎn)排放廢物少及副產(chǎn)物少等，也令制藥企業(yè)更多地投入到這一綠色合成等領(lǐng)域。事實(shí)上，因多肽藥物的較好應(yīng)用前景，其已成為應(yīng)用生命科學(xué)及藥物化學(xué)研發(fā)的重點(diǎn)之一。本文綜述了多肽藥物的合成研究進(jìn)展，闡述了多肽合成中液相合成法及固相的合成方法，并對多肽藥物的前景進(jìn)行了展望。

多肽藥物和診斷試劑已引起我國的高度重視，我國制定的“十五”期間生物醫(yī)藥研究的重點(diǎn)方向之一就是多肽藥物和診斷試劑。在未來幾年里將會有大量的多肽藥物和試劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)。隨著各種技術(shù)手段的不斷提高，相信未來多肽藥物具有不可估量的應(yīng)用前景。[14-16]

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