SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PHBHHx上的粘附和增殖

周祥文　馬敏先

【摘要】 目的：探討SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在3-羥基丁酸/3-羥基己酸共聚物（PHBHHx）支架材料的上的粘附和增殖，進(jìn)一步驗證PHBHHx材料作為骨組織工程支架材料的可行性。方法：采用全骨髓貼壁篩選培養(yǎng)法對成年SD大鼠BMSCs分離培養(yǎng)，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。將第三代BMSCs與PHBHHx支架材料在體外復(fù)合培養(yǎng)，通過掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料的復(fù)合情況，用MTT法檢測材料對細(xì)胞黏附和增殖的影響。結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在PHBHHx支架材料表面及孔隙中良好的黏附和增殖。結(jié)論：SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與PHBHHx支架材料具有良好的體外相容性，PHBHHx可作為一種性能優(yōu)良的骨組織工程支架材料。

【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；PHBHHx；

【中圖分類號】R329.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0193-01

隨著臨床應(yīng)用的迅速發(fā)展，口腔種植技術(shù)已成為牙列缺損或缺失患者選擇的修復(fù)方法之一。骨組織工程是將患者或供者的特定細(xì)胞（干細(xì)胞、祖細(xì)胞）置于體外支架材料上生長，形成一個三維結(jié)構(gòu)，然后移植到患者體內(nèi)。

實驗將SD（Sprague & Dawley，SD）大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與3-羥基丁酸/3-羥基己酸共聚物（PHBHHx）支架材料體外復(fù)合培養(yǎng)，采用MTT法檢測其在支架材料上的粘附和增殖情況，從而評估PHBHHx（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate， PHBHHx）材料的生物相容性，為人工骨支架材料的選擇提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SD大鼠1～2月齡（貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心）。L-DMEM（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季清公司）。倒置相差顯微鏡（貴陽醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞實驗室），掃描電鏡（貴陽醫(yī)學(xué)院電鏡室）。支架材料PHBHHx（清華大學(xué)提供）。該材料為三維多孔立體結(jié)構(gòu)，孔徑200-300μm，孔隙率90%，且孔間相互連通。將制備好的材料切割成0.5cm×0.5cm×0.5cm的正方體塊，高溫高壓消毒備用。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分離培養(yǎng)

SPF（Specific pathogen Free， SPF）級健康1―2月齡SD大鼠，雌雄不限，斷頸處死，無菌條件下分離雙側(cè)股骨，剪去骨骺，用裝有D-Hank's 的注射器沖洗骨髓腔，1000rpm離心5min，去掉上清，用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種于培養(yǎng)瓶中，放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔一天換液一次，待細(xì)胞鋪滿瓶底約90%-95%時，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，按1：2比例傳代。倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)。

1.3 細(xì)胞生長曲線繪制

將傳至原代、第2代、第3代培養(yǎng)的細(xì)胞各以1106/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，次日起每日取4孔細(xì)胞，消化計數(shù)，每孔計數(shù)3次，取平均值，連續(xù)6天，以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，描繪細(xì)胞生長曲線。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以x（_）±s表示，進(jìn)行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的增殖測定 BMSCs生長曲線呈s形，接種后第1-2d為潛伏期，第3d進(jìn)入對數(shù)生長期，4-5d達(dá)到高峰，第6d進(jìn)入平臺期。細(xì)胞的增殖速度隨著傳代次數(shù)的增加而增快（圖1）。

2.2 BMSCs在PHBHHx上的黏附情況

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在PHBHHx支架材料表面黏附，細(xì)胞呈多邊形，并伸出偽足固定于空隙之間，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能在該支架表面及空隙中很好的粘附及增殖。

2.3 MTT法檢測BMSCs在PHBHHx支架材料上的增殖情況

2.3.1繪制生長曲線

第1天 BMSCs能較好的附著在培養(yǎng)板上。第2-3天為生長適應(yīng)期，BMSCs增殖緩慢。4-6天進(jìn)入對數(shù)增長期，增殖速度加快。7天后進(jìn)入平臺期，部分細(xì)胞開始凋亡，增殖減緩（圖2）。

細(xì)胞接種的第1天，實驗組與對照組相比，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從第3天開始，兩組相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義?？梢哉J(rèn)為PHBHHx對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖影響具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3. 討論

組織工程是將種子細(xì)胞附著在支架材料上，細(xì)胞在支架逐步降解的同時能夠分化成新的組織和器官。種子細(xì)胞，支架材料，生長因子作為組織工程的三要素，在構(gòu)建組織工程骨中有舉足輕重的作用。因此，找到一種理想的種子細(xì)胞和支架材料，并將兩者有機結(jié)合起來已成為目前組織工程研究的熱點。

本實驗選用的PHBHHx具有良好的生物降解性，在所評價的多種可降解材料中，其溶血發(fā)生率最低，由于其最終分解為CO2和水，PH呈弱酸性，所以體內(nèi)植入后發(fā)生炎癥的概率較低，是近幾年來頗受關(guān)注的生物支架材料。通過掃描電鏡可觀察到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞伸出偽足附著在PHBHHx支架材料表面及孔隙中，且通過實驗組和對照組的比較可見，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅能在支架上增殖，而且支架材料能加快增殖的速度。

參考文獻(xiàn)

[1]侯萍等.間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征及體外向血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù).2007；11（20）：4021-4024.

[2]葉川，尹培榮，吳承龍.明膠海綿與人胚半月板細(xì)胞構(gòu)建復(fù)合物的研究.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報.2005，30（1）：15-17.