定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析鏈霉素耐藥和敏感結(jié)核分枝桿菌臨床

分離株　孫艷蕾

【摘要】目的：研究分析敏感結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥相關(guān)的潛在菌體蛋白。方法：通過使用結(jié)核分枝桿菌臨床分析鏈霉素敏感株05和結(jié)核分枝桿菌H37Rv，并以其為對照，使用iTRAQ技術(shù)和生物信息學(xué)對結(jié)核分枝桿菌臨床分離株鏈霉素耐藥株08菌體蛋白進(jìn)行鑒定和定量分析，并通過WeGo功能注釋聚類分析菌株的差異表達(dá)蛋白細(xì)胞組分和分析的功能以及其生物進(jìn)程等內(nèi)容。結(jié)果：08菌株分別與05菌株和H37Rv菌株比較差異表達(dá)為196個和138個，其中共同差異表達(dá)蛋白為119個。其中差異表達(dá)蛋白理論相對分子量的分布比較廣，其生物進(jìn)程主要參與在中間代謝、脂質(zhì)代謝以及呼吸作用中，其分子功能主要是催化活性和結(jié)合功能。其中共同差異表達(dá)蛋白分別為：8個核糖體蛋白在08菌株中表達(dá)下調(diào)、8個蛋白在08菌株中差異表達(dá)比較顯著。結(jié)論：使用iTRAQ技術(shù)可以有效的發(fā)展鏈霉素耐藥結(jié)核分枝桿菌相對于鏈霉素敏感結(jié)核分枝桿菌以及H37Rv菌株共同差異表達(dá)蛋白，可以為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥機制提供一定的依據(jù)和條件。

【關(guān)鍵詞】定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析；鏈霉素；耐藥；敏感結(jié)核分枝桿菌；臨床分離株

【中圖分類號】93A 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0181-02

根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核疾病中，主要是耐多藥結(jié)核為主，因此，導(dǎo)致耐藥結(jié)核病的診斷和治療具有較大的困難。其中鏈霉素是一種氨基葡萄糖型的抗生素，對抗結(jié)核分枝桿菌具有一定的作用。目前針對結(jié)核病的治療主要是依靠利福平、鏈霉素、異煙肼等聯(lián)合化療，但是鏈霉素耐藥結(jié)核分枝桿菌普遍存在，導(dǎo)致在治療方面具有嚴(yán)重的影響[1]。通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，可以全面的定量分析差異表達(dá)蛋白，為鑒定蛋白提供了較好的方式和手段。本研究通過對鏈霉素耐藥和敏感結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，現(xiàn)報告如下。

1.材料與方法

1.1一般材料

其一，菌株。結(jié)核分枝桿菌臨床分離鏈霉素敏感株05以及結(jié)核分枝桿菌臨床分離鏈霉素耐藥株08，用于抽提菌體蛋白的臨床分離株和H37Rv菌株主要是由國家結(jié)核病參比實驗室提供，菌體經(jīng)鈷 60 照射滅活之后，保存在零下80攝氏度中以便備用。

其二，主要試劑和儀器。iTRAQ標(biāo)試劑盒、胰蛋白酶、定量試劑盒，另外還包括半制備型HPLC、強陽離子交換柱和C18反相色譜柱等。

1.2方法

1.2.1全菌體蛋白的提取措施

滅活之后的結(jié)核分枝桿菌通過30分鐘洗滌，30分鐘離心處理，使用30ml的裂解液懸浮沉淀，同時使用高壓均質(zhì)破碎儀器進(jìn)行破菌處理，其中溶液的總體積要確保在50ml以內(nèi)。通過四次循環(huán)破菌處理之后，再次進(jìn)行30分鐘離心處理，并取20ml上清，加入5ml50%的TCA / 丙酮，使用冰水淋浴2小時，離心30分鐘之后使用零下20攝氏度的預(yù)冷丙酮洗滌沉淀物3次，并將其晾干處理。沉淀物就是菌體蛋白的樣品，將其放置在零下80℃以便備用。

1.2.2全菌體蛋白復(fù)溶及定量

將部分沉淀物放置在1.5ml的離心管中，并加入復(fù)溶Buffer ，最終濃度為1mmol / L。乙二胺四乙酸的最終濃度為2 m mol / L。將其混合均勻之后放置5分鐘，并加入二硫蘇糖醇，使得其最終濃度為10 m mol / L。并使用超聲助溶5分鐘，離心處理25分鐘，上清于56℃的水浴1小時之后取出，并迅速的加入碘乙酰胺，當(dāng)最終濃度達(dá)到55-100 m mol / L之后，放置在暗室靜置1小時。之后加入4倍體積的預(yù)冷丙酮，放置在零下20℃的環(huán)境中沉淀3小時。離心處理之后棄上清。并使用300μL 的0. 1% SDS 的溶液和50%TEAB進(jìn)行復(fù)溶沉淀，超聲助溶3分鐘，使用定量檢測總蛋白的提取量。

1.2.3蛋白質(zhì)酶解

在每個樣品中取出100μg 的蛋白，并且使用0. 1%的SDS 溶液和50%的TEAB溶液補齊相同的體積。在每100μg 蛋白質(zhì)的樣品中加入3.4μg 的胰蛋白酶，并放置在37攝氏度的水浴中，其放置時間為24小時。

1.2.4生物學(xué)分析

其中質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過相關(guān)軟件自動分析標(biāo)峰，得出相關(guān)文件，并下載結(jié)核分枝桿菌的數(shù)據(jù)，將其作為搜索數(shù)據(jù)庫，通過搜索引擎進(jìn)行本地搜索，對蛋白質(zhì)鑒定進(jìn)行評價打分。差異蛋白質(zhì)的定量主要以搜庫的結(jié)果為前提基礎(chǔ)，根據(jù)軟件的加權(quán)方式，將08菌株分別與05菌株和H37Rv菌株相比，直接顯示相對定量結(jié)果，根據(jù)不同的鑒定次數(shù)進(jìn)行分析研究，并通過WeGO功能注釋聚類分析差異蛋白細(xì)胞的組分、分子功能以及生物的進(jìn)程等情況。

2.結(jié)果

2.1菌株的特點

05菌株是北京基因型，對鏈霉素、異煙肼以及利福平等藥物均具有一定的敏感想，08菌株是非北京基因型，只是對鏈霉素具有耐藥性。05菌株和08菌株的毒性相似，并且均高于標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv。

2.2菌體蛋白鑒定和相對定量

通過鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，共鑒定到659個蛋白質(zhì)，其中有意義的定量蛋白質(zhì)為327個。08菌株分別與05菌株和H37Rv菌株比較差異表達(dá)為196個和138個，其中共同差異表達(dá)蛋白為119個。其中差異表達(dá)蛋白理論相對分子量的分布比較廣，其生物進(jìn)程主要參與在中間代謝、脂質(zhì)代謝以及呼吸作用中，其分子功能主要是催化活性功能和結(jié)合功能。其中共同差異表達(dá)蛋白分別為：8個核糖體蛋白在08菌株中表達(dá)下調(diào)、8個蛋白在08菌株中差異表達(dá)比較顯著。

3.討論

鏈霉素是一種抗結(jié)核藥物，通常和結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白質(zhì)量共同作用于結(jié)核病，以便達(dá)到抑制其蛋白質(zhì)合成的目的，從而取得較好的治療效果。本研究中通過使用iTRAQ技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分析研究，有效的克服了經(jīng)典雙向凝膠電池存在的低分辨率和低敏感性的缺點，可以在任何類型的蛋白質(zhì)中進(jìn)行鑒定，并且可以同時定量8個以上的樣品，從而有效的縮小了不同樣品和不同批次間的實驗誤差，具有較好的重復(fù)作用[2]。

本研究中通過iTRAQ技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌臨床分離鏈霉素耐藥株08、鏈霉素05敏感株以及標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究，對鏈霉素耐藥株08和鏈霉素05敏感株以及標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv進(jìn)行鑒定，共鑒定到共同差異表達(dá)蛋白119個，主要為代謝相關(guān)蛋白。

綜上所述，使用iTRAQ技術(shù)可以有效的發(fā)展鏈霉素耐藥結(jié)核分枝桿菌相對于鏈霉素敏感結(jié)核分枝桿菌以及H37Rv菌株共同差異表達(dá)蛋白，可以為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥機制提供一定的依據(jù)和條件。

參考文獻(xiàn)

[1]劉東.研究生蛋白質(zhì)組學(xué)教學(xué)改革與實踐[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013（3）：15.

[2]朱傳智. 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析鏈霉素耐藥和敏感結(jié)核分枝桿菌臨床分離株[J].微生物學(xué)報，2010（8）：147.