益母草顆粒微生物限度檢查方法驗(yàn)證

馬淑艷

【摘要】按照《中國(guó)藥典》2005年版附錄對(duì)微生物限度檢查的要求，采用常規(guī)法對(duì)益母草顆粒進(jìn)行微生物限度檢查方法的驗(yàn)證，確認(rèn)所采用的方法適合于益母草顆粒的微生物限度檢查，即確認(rèn)益母草在該檢驗(yàn)量，該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不計(jì)，以保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。結(jié)果表明，益母草顆粒無(wú)抑菌作用，常規(guī)法對(duì)無(wú)抑菌作用的益母草顆粒進(jìn)行微生物限度檢查的結(jié)果可靠，準(zhǔn)確。

【關(guān)鍵詞】益母草顆粒；微生物限度檢查；方法驗(yàn)證

【中圖分類號(hào)】R917 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）02-0168-01

藥品微生物限度檢查是控制藥品微生物污染的重要手段，包括細(xì)菌，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)及控制菌檢查，是藥品安全性的重要指標(biāo)之一。隨著藥品劑型的日益發(fā)展和藥品標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，及時(shí)有效地進(jìn)行藥品微生物限度檢查是擺在藥檢工作人員面前的重大課題。藥品微生物限度檢查方法為《中國(guó)藥典》1995年版首次收載，并在《中國(guó)藥典》2005年版增訂了方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為藥品微生物限度檢查結(jié)果的可靠性提供了保障。

在做微生物限度檢查時(shí)，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有抑菌作用，那么對(duì)有抑菌作用的藥物按常規(guī)法做微生物限度經(jīng)常藥品，以確認(rèn)所 采用的方法適合該樣品的微生物限度檢查。本文結(jié)合執(zhí)行《這個(gè)藥典》2005年版及《美國(guó)藥典》28版，《英國(guó)藥典》2002版有關(guān)微生物限度檢查法，按照中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范及有關(guān)文獻(xiàn)，以益母草顆粒為例。益母草顆粒為治療月經(jīng)量少，產(chǎn)后腹痛的藥物，具有活血調(diào)經(jīng)的功效。藥品中含有益母草一味中藥材成分，固益母草沒有抑菌作用，可采用常規(guī)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，最終確定采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)，霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)的測(cè)定，采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌的檢查，經(jīng)對(duì)所采用的方法進(jìn)行驗(yàn)證，符合2005年版《這個(gè)藥典》二部附錄ⅪJ有管微生物限度檢查法有關(guān)規(guī)定，方法可行。

益母草為唇形科植物益母草的干燥全草，又名茺蔚，益母蒿，坤草，月母草，地母草等，原生于山野荒地，田埂，河灘，草地，路旁，溪邊等處，全國(guó)各地均有分布，部分地區(qū)有栽培，是常用的中藥材品種。

益母草的化學(xué)成分主要有：①生物堿，近幾年在生物堿的提取方法方面有了很大的改進(jìn)，郭孝武等采用不同頻率的超聲波技術(shù)，該法工藝簡(jiǎn)單，提取率高，有較高的開發(fā)價(jià)值。王坤等用外循環(huán)灌裝式提取工藝，提取率高并且節(jié)省能源，縮短生產(chǎn)周期，適用工業(yè)化生產(chǎn)。葛發(fā)歡等常用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)比常規(guī)法提高10倍；②二萜，從益母草中分離出34個(gè)二萜類成分，其中Labdane型二萜類成分prehispanone是一種血小板活化因子的拮抗劑，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制血小板上的血小板凝聚因子（PDF）受體，從而達(dá)到抗凝血目的。近期張嫻等又從益母草中分離出2個(gè)化合物益母草酮A，β—谷甾醇，其中化合物益母草酮A為一種新的Labdane型化合物；③阿魏酸，羅毅等自益母草中提取分離出阿魏酸，并對(duì)其進(jìn)行色譜鑒定，初步確定益母草種含有阿魏酸。研究者采用薄層色譜法和HPLC法鑒別不同提取溶媒制備的樣品，各樣品均從益母草中檢出阿魏酸以百分之五的碳酸鈉超聲提取最好；④揮發(fā)油，王金輝等和叢悅等近期又從益母草的干燥地上部分的水提取物中經(jīng)過(guò)大孔樹脂，硅膠柱色譜，制備色譜和HPLC分離得到2個(gè)化合物，首次從該種植物中分離得到2，6-二甲基-2E，7-辛二稀-1，6-二醇和ajugoside。⑤其他，多糖：劉曉河等采用水楊酸法測(cè)定還原性單糖的含量和水解后的總糖含量，從而間接測(cè)出益母草中的多糖含量，該方法簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確，消除了樣品中還原性單糖對(duì)多糖含量測(cè)定的影響。微量元素：任曉偉等從細(xì)花益母草中測(cè)定到微量元素的存在，并且葉和花中的微量元素多與莖中的微量元素，與調(diào)經(jīng)活血的機(jī)制是一致的；其他的還有黃酮，苷類如環(huán)烯醚萜苷類，苯丙醇苷類，強(qiáng)心甾苷類等。

益母草的藥理活性主要有抗血栓形成，利尿，改善淋巴系統(tǒng)，興奮子宮，抗誘變作用，減少心肌損害。

1. 樣品名稱及來(lái)源

名稱：益母草顆粒

批號(hào)：1508014

生產(chǎn)廠家：廣西靈峰藥業(yè)有限公司

處方組成：益母草，蔗糖，糊精

2. 試驗(yàn)材料及儀器

儀器：35℃恒溫培養(yǎng)箱：303A-6型 北京北德工貿(mào)有限公司

33℃恒溫培養(yǎng)箱：303A-6型 北京北德工貿(mào)有限公司

25℃恒溫培養(yǎng)箱：303A-6型 北京北德工貿(mào)有限公司

高壓蒸汽滅菌器：LDZX-40Ⅱ型 上海申安醫(yī)療器械廠

調(diào)速多用振蕩器：HY-2 國(guó)華電器有限公司

電子天平：SL102N 上海民橋精密儀器廠

試驗(yàn)菌株：

大腸埃希菌 Escherichia Coli [CMCC（B）44102]

金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus [CMCC9（B）26003]

枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis [CMCC（B）63501]

白色念珠菌 Candida albicans [CMCC（F）98001]

黑曲霉菌 Aspergillus niger [CMCC（F）98003]

對(duì)菌株的要求：驗(yàn)證試驗(yàn)所用的大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉菌的傳代次數(shù)均不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍買那個(gè)干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)活性。

稀釋劑：PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京奧博星生物技術(shù)有限公司），0.9%無(wú)菌氯化鈉（本所配制）

培養(yǎng)基（由北京奧博星生物技術(shù)有限公司，北京三藥科技開發(fā)公司提供）

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào) 060412），改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)060412），改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)060105），營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)060412），膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號(hào)060412），膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（批號(hào) 060207），玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（060412）

消毒液：0.1%苯扎溴銨溶液（供洗手，擦試操作臺(tái)面用），75%乙醇溶液

3. 試驗(yàn)部分

3.1菌液制備

接種大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，35-37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml含50—100cfu的菌懸液。

接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23-28℃培養(yǎng)24—48小時(shí)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml含50—100cfu的菌懸液。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23-28℃培養(yǎng)5—7天，使大量的孢子產(chǎn)生，加入3—5ml的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用墊有脫脂棉的漏斗（濕熱滅菌）過(guò)濾，除去菌絲，取此菌原液0.1ml用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml含50—100cfu的孢子懸液備用。

3.2菌落計(jì)數(shù)（每種菌接種兩個(gè)平皿）

上述大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌三種菌液在試驗(yàn)的同時(shí)分別取1ml，置直徑90mm的無(wú)菌平皿中，注入15—20ml溫度不超過(guò)45℃的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，迅速混勻，凝固，35℃倒置培養(yǎng)。取黑曲霉，白色念珠菌菌液各1ml，置直徑90mm的無(wú)菌平皿中，注入15—20ml溫度不超過(guò)45℃的溶化的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，迅速混勻，凝固，25℃倒置培養(yǎng)。

取供試品10g，加PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，制成1：10的供試液備用。

3.4菌落計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證（常規(guī)法）

㈠ 細(xì)菌，霉菌及酵母菌檢查法驗(yàn)證

當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌，霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定，若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新驗(yàn)證。

①試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml，分別注入兩個(gè)無(wú)菌平皿，每個(gè)平皿加試驗(yàn)菌1ml，立即注入45℃的溶化的相應(yīng)培養(yǎng)基15—20ml，搖勻，凝固后，將平皿倒置，于規(guī)定的溫度培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間，做菌落計(jì)數(shù)。

②菌液組：取稀釋好的各菌液1ml，分別加入無(wú)菌平皿中，加入相應(yīng)培養(yǎng)基，置規(guī)定條件培養(yǎng)，測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)，每株試驗(yàn)菌制備二個(gè)平皿。

③供試品對(duì)照組：測(cè)定供試品本底菌數(shù)，方法同試驗(yàn)組（不加菌液）。

④稀釋劑對(duì)照組：分別取稀釋劑1ml，加入含50—100cfuml的試驗(yàn)菌測(cè)定其菌數(shù)。

回收率的計(jì)算公式：

稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)

稀釋劑對(duì)照組菌回收率=───────────────×100%

菌液組的平均菌落數(shù)

試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)—供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)

試驗(yàn)組菌回收率=──────────────────────×100%

菌液組的平均菌落數(shù)

81㈡控制菌檢查法的驗(yàn)證（常規(guī)法）

當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查，若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。

驗(yàn)證時(shí)，依個(gè)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，應(yīng)采用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。

①試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml，加膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml，再加1ml陽(yáng)性菌（即大腸埃希菌數(shù)，霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)驗(yàn)證）搖勻；取膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基1支，加1：10供試液1ml，再加1ml大腸埃希菌，搖勻，置30--35℃培養(yǎng)18—48小時(shí)。

②陰性對(duì)照組：方法同試驗(yàn)組，分別加入1ml陰性菌（即金黃色葡萄球菌，濃度同細(xì)菌數(shù)，霉菌數(shù)及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證）。

4.結(jié)論

①計(jì)數(shù)法驗(yàn)證：在三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率均不低于70%，故可照該供試品制備方法和計(jì)數(shù)法，測(cè)定益母草顆粒的細(xì)菌，霉菌及酵母菌數(shù)。

②控制菌檢查法驗(yàn)證：陰性對(duì)照菌未檢出陽(yáng)性對(duì)照菌，試驗(yàn)組檢出陽(yáng)性菌，故可照此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行益母草顆粒的控制菌檢查。

4. 討論

操作環(huán)節(jié)對(duì)回收率有影響，在注入1ml供試液后，隨即加入50—100cfu的菌懸液，此時(shí)未注入培養(yǎng)基，菌懸液暫時(shí)與高濃度供試液混合或不完全混合，若此供試品有較強(qiáng)的抑菌作用，則較高濃度的供試液無(wú)疑會(huì)對(duì)菌懸液中的活菌數(shù)帶來(lái)影響，因此，要盡快注入培養(yǎng)基，并且立即將培養(yǎng)基搖勻，以免菌落數(shù)過(guò)于集中不便于最后計(jì)數(shù)。

為減少實(shí)驗(yàn)誤差，建議在操作過(guò)程中應(yīng)遵循以下原則：為了防止二次污染和微生物繁殖或死亡，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用紫外燈照射樣品的外包裝，檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從兩個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品；實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)符合2005年版《中國(guó)藥典》提出的要求，微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染；實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存及菌液的制備應(yīng)符合藥典要求。

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