巢式一實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)慢性乙型肝炎患者PBMC中HBVcccDNA的實(shí)用性評(píng)估

楊慧慧

【摘要】 目的 評(píng)估巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)慢性乙型肝炎患者PBMC中HVB cccDNA的實(shí)用性。方法 利用巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)慢性乙型肝炎患者肝組織和PBMC中HVB cccDNA水平。結(jié)果 20例血清HBV DNA均為陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者肝組織和外周血PBMC中ccDNA陽(yáng)性率分別為55%（11/20）和45%（9/20），兩者的符合率為90%。結(jié)論 利用巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA能較真實(shí)地反映HBV的復(fù)制。該方法可能是一種評(píng)價(jià)抗病毒藥物的療效，觀察乙型肝炎患者病情的變化的有效手段，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒，乙型；DNA，環(huán)狀；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；單核細(xì)胞

【中圖分類號(hào)】R51216 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）02-0048-02

乙型肝炎病毒（HBV）復(fù)制有其獨(dú)特的地方，首先形成共價(jià)閉合環(huán)DNA（covlently closed circular DNA，cccDNA），然后轉(zhuǎn)錄成前基因組RNA，最后在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成病毒基因組DNA，故cccDNA是HBV復(fù)制的突出標(biāo)志[1]。cccDNA主要存在宿主的細(xì)胞核，既往均采用肝組織檢測(cè)DNA，但取材困難，限制了臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞同樣存在HBV感染復(fù)制現(xiàn)象[2，3]，故檢測(cè)外周血HBV cccDNA同樣能反映HBV復(fù)制狀況及評(píng)價(jià)藥物療效，且比肝組織更方便，只是外周血cccDNA濃度較低，易出現(xiàn)假陰性。為了評(píng)估巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在檢測(cè)慢性乙型肝炎患者PBMC中HVB cccDNA的實(shí)用性，筆者擬利用巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法同時(shí)檢測(cè)慢性乙肝患者肝組織和PBMC中HVB cccDNA的含量，以期為臨床檢測(cè)HCV復(fù)制狀況及評(píng)價(jià)藥物療效提供簡(jiǎn)便有效的方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 選取長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院傳染科確診的慢性乙型肝炎患者20例，男13例，女7例，平均年齡46.8歲（28～65歲），所有患者均未進(jìn)行任何治療。每例病例分別采取全血10ml和行肝穿刺獲取肝組織；全血采用密度梯度離心法分離PBMC，洗滌5次后檢測(cè)上清液中HBV DNA，確認(rèn)HBV DNA PCR結(jié)果為陰性后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，取1×106細(xì)胞備用。肝組織用生理鹽水清洗4次，入液氮保存?zhèn)溆?。aywHBV全序列的pcp10質(zhì)粒，采用p-GEM-T-Easy載體構(gòu)建，用作檢測(cè)HBV cccDNA的陽(yáng)性參照定量標(biāo)準(zhǔn)品，提取陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，測(cè)定核酸濃度，倍比稀釋為5.0×102～5.0×109拷貝/ml，作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。

1.2 引物與探針的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)HBV cccDNA與松弛結(jié)構(gòu)DNA（rcDNA）結(jié)構(gòu)上的差異，跨HBV DNA雙鏈缺口兩側(cè)選擇區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)內(nèi)外引物，并在負(fù)鏈缺口下游設(shè)計(jì)TaqMan熒光探針。所有設(shè)計(jì)的引物能選擇性地?cái)U(kuò)增HBV cccDNA，而不能擴(kuò)增rcDNA。P1引物：5-CGC TTT CGG GTC CCT CAT GCG ACG TGC-3，P2引物：5-TCG CTT TCG GGT CCC T-3，P3引物：5-GCA CCT CTC TTT ACG CGG TC-3，P4引物：5-AAC TGA AAG CCA AAC AGT G-3，TaqMan熒光探針：5-FAM-CTC TGC C-TAA TCA TCT CAT GTT CAT-TAMRA-3，外引物擴(kuò)增片段為385bp，內(nèi)引物擴(kuò)增片段為105bp。

1.3 主要試劑 基因組提取試劑盒、HBV DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒均購(gòu)自北京索奧生物技術(shù)公司，CR Master Mix試劑購(gòu)自日本東洋坊公司。

1.4 DNA抽提 利用質(zhì)粒抽提試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作提取PBMC及肝組織中病毒DNA。

1.5 巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 取純化模板2μl，用外引物進(jìn)行第一輪常規(guī)PCR擴(kuò)增。外引物P1和P2濃度為10μmol/L，各1μl，10mmoldNTP 0.5μl，Taq酶0.5μl，10×buffer 2μl，ddH2O 13μl；循環(huán)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。第二輪反應(yīng)用內(nèi)引物和熒光探針對(duì)第一輪PCR產(chǎn)物中的目的片段進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：第一輪PCR產(chǎn)物2μl，2×Taq PCR Master Mix 12μl，P3、P4引物各1μl，10μmol/L熒光探針0.5μl，反應(yīng)總體積20μl；循環(huán)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。設(shè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照為aywHBV全序列的pcp10質(zhì)粒，陰性對(duì)照為3例健康獻(xiàn)血員。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織和外周血中PBMC中cccDNA檢測(cè)結(jié)果 第一輪PCR產(chǎn)物電泳在385bp處見(jiàn)陽(yáng)性條帶，第4，6，7，8，10，12，13泳道呈陽(yáng)性（圖1）。20例血清HBV DNA均為陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者肝組織中ccDNA陽(yáng)性者10例，陽(yáng)性率為50%（10/20）。cccDNA定量值為4.214×104～5.211×105拷貝/ml。外周血PBMC中cccDNA陽(yáng)性者9例，陽(yáng)性率45%（9/20）。cccDNA定量值為3.521×103～3.452×104拷貝/ml。3例健康獻(xiàn)血員PBMC中cccDNA均陰性。

2.2 外周血PBMC和肝組織中cccDNA陽(yáng)性的符合率 9例外周血PBMC中cccDNA陽(yáng)性患者的肝組織中cccDNA均陽(yáng)性，但有1例肝組織中cccDNA陽(yáng)性患者其外周血PBMC中cccDNA陰性，外周血PBMC和肝組織中cccDNA陽(yáng)性的符合率高達(dá)90%（9/10）。

2.3 方法的敏感性 檢測(cè)pcp10陽(yáng)性參照定量標(biāo)準(zhǔn)品，得到該方法的靈敏度為2log10拷貝/ml范圍，隨著模板量減少，對(duì)應(yīng)CT值增大，呈線性相關(guān)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

3 討 論

臨床上一般以HBV DNA載量作為抗病毒治療依據(jù)及判斷乙肝病毒復(fù)制活力，HBV DNA包括rcDNA和ceeDNA。有學(xué)者認(rèn)為單純依靠血清HBV DNA檢測(cè)是不夠的，應(yīng)結(jié)合HBV cccDNA的檢測(cè)和臨床來(lái)進(jìn)行綜合分析，才能更真實(shí)地反應(yīng)患者體內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制，為臨床治療提供更為可靠的依據(jù)[4]。cccDNA的清除預(yù)示著HBV在宿主體內(nèi)生命周期的終結(jié)，因此不少學(xué)者認(rèn)為這是最佳的抗病毒參考指標(biāo)之一[4]。HBV cccDNA的檢測(cè)能夠評(píng)價(jià)抗病毒藥物的療效，連續(xù)觀察更能反映乙型肝炎患者病情的變化，所以準(zhǔn)確、方便、快速檢測(cè)cccDNA的量是目前乙肝治療的迫切要求。乙型肝炎病毒HBV cccDNA研究以肝組織為多，但肝組織取材困難，臨床應(yīng)用受到了極大的限制。HBV可以感染白細(xì)胞，而這種免疫細(xì)胞的感染有利于病毒免疫逃逸，不被免疫細(xì)胞攻擊，從而導(dǎo)致機(jī)體清楚HBV能力下降，故外周血PBMC中存在HBV感染和復(fù)制，檢測(cè)外周血PBMC中cccDNA應(yīng)該亦能反映HCV的復(fù)制，但血液中cccDNA的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肝組織，檢測(cè)亦較為困難。

巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有高靈敏性和高特異性，能夠檢測(cè)極其微量的DNA。cccDNA有共價(jià)、閉合、超螺旋雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，在堿變性后可再?gòu)?fù)性，而rcDNA是有缺口的雙鏈DNA，堿變性后不可復(fù)性 所以本實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒抽提肝組織和PBMC中的病毒DNA可以祛除rcDNA、單鏈DNA和RNA，對(duì)cccDNA進(jìn)行純化，可進(jìn)一步提高cccDNA檢測(cè)的靈敏性和特異性[5]。

本研究結(jié)果顯示，利用巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)20例血清HBV DNA陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者的肝組織和PBMC中的cccDNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肝組織和PBMC中cccDNA的陽(yáng)性率分別為50%和45%，且兩者的符合率高達(dá)90%，表明利用巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)外周血PBMC中的cccDNA亦能較真實(shí)的反映HBV的復(fù)制，可以避免由于肝組織取材帶來(lái)的限制，且準(zhǔn)確、方便、快捷，是一種評(píng)價(jià)抗病毒藥物的療效，觀察乙型肝炎患者病情的變化的有效手段，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

參考文獻(xiàn)

[1]陳延平. 檢測(cè)HBVcccDNA的巢式-實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用[D].第四軍醫(yī)大學(xué)，2007.

[2]陳勇. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV cccDNA體系建立及臨床應(yīng)用初步研究[D].重慶醫(yī)科大學(xué)，2008.

[3]陳延平，孟存英，徐光華，馮繼紅，王平忠，白雪帆. 應(yīng)用巢式-實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA[J]. 肝臟，2011，05：401-404.