氧化型鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ

孫勝男 呂菁君 魏捷

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.026

基金項(xiàng)目： 國家自然科學(xué)基金（81372020）; 湖北省衛(wèi)生廳青年科技人才項(xiàng)目（QJX 2012-11）;武漢市首批中青年醫(yī)學(xué)骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目

作者單位：430060 武漢，武漢大學(xué)人民醫(yī)院急診科

通信作者：呂菁君 ，Email： lvjingjun@gmail.com

鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶家族（Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase， CaMK）包括CaMKⅠ，CaMKⅡ，CaMKⅢ，CaMKⅣ。其中CaMKⅡ在體內(nèi)廣泛分布，在心肌細(xì)胞中高表達(dá)。鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為Ca²⁺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子，調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，包括氨基酸和脂質(zhì)代謝，離子通道/受體及神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，調(diào)控興奮收縮耦聯(lián)作用。

近年來，蛋白質(zhì)翻譯后修飾與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制之間的內(nèi)在聯(lián)系受到關(guān)注。氧化型Ca²⁺/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ的發(fā)現(xiàn)將Ca²⁺與氧化應(yīng)激緊密的聯(lián)系在一起，NADPH氧化酶/CaMKⅡ 信號(hào)通路在心肌梗死后心室重構(gòu)、病態(tài)竇房結(jié)綜合征的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵性致病作用。氧化型鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ的激活位點(diǎn)、激活通路以及下游效應(yīng)產(chǎn)物成為新的關(guān)注點(diǎn)。

1 CaMKⅡ 蛋白翻譯后修飾

鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ， CaMKⅡ）在20年前被確定是由Ca²⁺/ CaM 依賴激活的，其磷酸化位點(diǎn)是 CaMKⅡ蛋白活性調(diào)節(jié)區(qū)域第287蘇氨酸（Thr287）。研究表明，在沒有Ca²⁺/ CaM 參與下，血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo) CaMKⅡ蛋白活性調(diào)節(jié)區(qū)域第281和第282雙蛋氨酸結(jié)構(gòu)氧化，形成氧化型CaMKⅡ（oxidized-CaMKⅡ），導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[1-2]。進(jìn)一步的研究表明，CaMKⅡ 第281 / 282 雙蛋氨酸結(jié)構(gòu)氧化激活（oxidized-CaMKⅡ）與CaMKⅡ第287蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化激活（phos-CaMKⅡ）是完全獨(dú)立的兩個(gè)過程，并不相互依賴（圖 1）。

研究表明，CaMKⅡ的激活存在多種形式，不僅有Thr287磷酸化激活、第281和第282雙蛋氨酸氧化激活，糖尿病，長期高血糖導(dǎo)致CaMKⅡ蛋白活性調(diào)節(jié)區(qū)域第280絲氨酸（Ser280）糖基化;交感神經(jīng)興奮、神經(jīng)內(nèi)分泌過度不僅磷酸化激活第287蘇氨酸（Thr287），還導(dǎo)致第272半胱氨酸（Cys272）和第290半胱氨酸（Cys290） 硝基化。

2 CaMK Ⅱ在心臟中的激活通路

鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ在心臟中的激活通路主要通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）和β-腎上腺素能受體信號(hào)通路（圖2）。在心肌細(xì)胞中RAAS系統(tǒng)通過AT1受體/NADPH氧化酶信號(hào)通路氧化激活CaMKⅡ，同時(shí)也能導(dǎo)致磷酸化激活CaMKⅡ蛋白 [3-5]。而β1-腎上腺素能受體信號(hào)通路主要磷酸化激活CaMKⅡ [6-8]。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶是體內(nèi)活性氧（ROS）的最主要的來源之一。NADPH氧化酶的經(jīng)典結(jié)構(gòu)由6個(gè)不同的亞單位組成，它們分別是位于細(xì)胞膜的核心亞基gp91 phox和調(diào)節(jié)亞基p22phox，二者形成的膜復(fù)合體稱為黃素細(xì)胞色素b558，以及位于胞質(zhì)中的水溶性調(diào)節(jié)亞基Rac、p67phox、p47phox、p40 phox等。在NADPH氧化酶激活時(shí)，胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)亞基轉(zhuǎn)位與黃素細(xì)胞色素b558結(jié)合，含黃素的gp91 phox催化亞基作為電子傳遞系統(tǒng)，以NADPH為遞氫體，催化反應(yīng)：

NADPH+2O₂→NADP⁺+H⁺+2O^2-。超氧化物陰離子（O^2-）在超氧化物歧化酶的作用下轉(zhuǎn)化成H₂O₂。O^2-和 H₂O₂都是損傷細(xì)胞最強(qiáng)的自由基。

血管緊張素激動(dòng)血管緊張素1受體（AT1受體）誘導(dǎo)NADPH氧化酶活化，細(xì)胞內(nèi)大量的H₂O₂直接作用于CaMKⅡ蛋白活性調(diào)節(jié)區(qū)域第281/282雙蛋氨酸結(jié)構(gòu)，氧化激活CaMKⅡ。激動(dòng)AT1受體同時(shí)也能導(dǎo)致CaMKⅡ蛋白活性調(diào)節(jié)區(qū)域第287蘇氨酸磷酸化激活。Mark E Anderson 團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究證明，異丙腎上腺素通過β1-腎上腺素能受體信號(hào)通路，導(dǎo)致CaMKⅡ蛋白活性調(diào)節(jié)區(qū)域第287蘇氨酸磷酸化激活，并不作用于第281/282 蛋氨酸[3-5]。

蛋氨酸亞砜還原酶A（methionine sulfoxide reductase A， MsrA）是目前發(fā)現(xiàn)的可在體內(nèi)還原逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)蛋氨酸殘基氧化結(jié)構(gòu)變化和功能損傷的主要抗氧化酶系統(tǒng)。研究表明，與超氧化物歧化酶（SOD）相比，MsrA不僅可以在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮清除氧化因子的作用，還可以對(duì)已經(jīng)發(fā)生的蛋白質(zhì)氧化進(jìn)行可逆性修復(fù)。在心肌細(xì)胞內(nèi)，oxidized-CaMKⅡ第281 / 282 雙蛋氨酸結(jié)構(gòu)氧化修復(fù)是通過MsrA介導(dǎo)的。在MsrA作用下，心肌細(xì)胞內(nèi)oxidized-CaMKⅡ氧化還原（圖2）。過表達(dá)MsrA基因可以顯著減輕氧化應(yīng)激引發(fā)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡[9]。

3 phos-CaMKⅡ和oxidized-CaMKⅡ在心血管病理生理中的作用

美國加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校的Xie等[26]采用膜片鉗和鈣內(nèi)流成像負(fù)荷技術(shù)，研究氧化應(yīng)激對(duì)家兔心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響：①由于H₂O₂氧化激活CaMK Ⅱ，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度顯著增加，觸發(fā)肌漿網(wǎng)在舒張期不恰當(dāng)?shù)剽}釋放，激活瞬時(shí)內(nèi)向電流（I_ti）引發(fā)延遲后除極。②H₂O₂（0.2～1.0 mmol/L）作用心室肌細(xì)胞5～15 min，影響INa失活，延長動(dòng)作電位時(shí)程。INa通道阻滯劑河豚毒素（10 μmol/ L）可以拮抗這一作用。③ H₂O₂增強(qiáng)I_Ca，L的峰值和延長動(dòng)作電位平臺(tái)期，增加鈣內(nèi)流，I_Ca，L阻滯劑硝苯地平可以拮抗這一作用。影響I_Na失活，擴(kuò)大I_Ca，L，延長動(dòng)作電位時(shí)程導(dǎo)致早期后除極現(xiàn)象的發(fā)生（圖3）。

CaMKⅡ抑制劑KN-93（1 μmol/ L）可以完全拮抗H₂O₂誘導(dǎo)EADs，無活性的KN-93異構(gòu)體KN-92無上述作用。選擇性CaMKⅡ磷酸化抑制劑AIP （autocamtide-2-related inhibitory peptide）2 μmol/ L也能顯著抑制H₂O₂誘導(dǎo)EADs發(fā)作。與CaMKⅡ抑制劑KN-93比較，CaMKⅡ磷酸化抑制劑AIP的抑制作用更多地表現(xiàn)在影響INa失活，CaMKⅡ抑制劑KN-93對(duì)I_Na失活和擴(kuò)大I_Ca，L都發(fā)揮作用。

Song Y-H 研究證實(shí)CaMKⅡ在短暫的氧化壓力下誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞L-型鈣電流（I_Ca，L） 長時(shí)程易化（long-term facilitation ， LTF） [21]。1 mmol/L H₂O₂作用大鼠心肌細(xì)胞5 min，L-型鈣電流長時(shí)程易化持續(xù)約1 h。CaMKⅡ抑制劑KN- 93能夠完全逆轉(zhuǎn)H₂O₂誘導(dǎo)的L-型鈣電流長時(shí)程易化。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，氧化激活CaMKⅡ和磷酸化激活CaMKⅡ都參與維持CaMKⅡ的活化。但是肌漿網(wǎng)Ca²⁺釋放和線粒體

ROS生成在持續(xù)CaMKⅡ活化中起關(guān)鍵作用。長時(shí)程的心肌動(dòng)作電位重構(gòu)是通過氧化CaMKⅡ介導(dǎo)的。線粒體氧化激活CaMKⅡ?qū)е屡c心律失常相關(guān)的病理性心肌細(xì)胞記憶。

3.4 oxidized-CaMKⅡ參與心肌缺血-再灌注損傷以及心肌梗死后的炎癥反應(yīng)

CaMKⅡ在心肌中的促炎作用是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)。CaMKⅡ參與心肌缺血-再灌注損傷以及心肌梗死后的炎癥反應(yīng)。Ling等[27]首次研究證實(shí)在心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡδ直接介導(dǎo)NF-κB激活，CaMKⅡδ觸發(fā)并維持缺血-再灌注損傷導(dǎo)致的炎癥基因表達(dá)。CaMKⅡδ基因缺失，減弱缺血-再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。基因敲除心臟特異性CaMKⅡδ可以保護(hù)心臟，減少缺血-再灌注損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡，減少梗死面積，改善心臟功能恢復(fù)。進(jìn)一步的研究表明，缺血-再灌注迅速增加CaMKⅡ的活性，在再灌注數(shù)分鐘內(nèi)活化NF-κB?；罨腃aMKⅡ在心肌細(xì)胞中的表達(dá)直接導(dǎo)致IκB激酶磷酸化，伴隨核P65的增加 。

在心肌梗死中，Toll樣受體-4促進(jìn)核因子κB依賴的炎癥反應(yīng)和氧化損傷。MyD88（myeloid differentiation protein 88）是Toll樣受體的重要下游信號(hào)和功能蛋白。2012年，Singh等[28] 研究發(fā)現(xiàn)脂多糖（LPS）激活Toll樣受體-4（TLR-4）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞CaMKⅡ氧化激活，補(bǔ)體因子B是oxidized-CaMKⅡ激活后的下游效應(yīng)蛋白。野生型小鼠心肌梗死后心臟中oxidized-CaMKⅡ顯著增加，但是MyD88基因敲除（MyD88-/-）小鼠心肌梗死后心臟由于缺乏MyD88依賴的Toll樣受體信號(hào)激活，不表達(dá)oxidized-CaMKⅡ。野生型小鼠心肌梗死后心臟中促炎因子TNF-α、補(bǔ)體因子B、心肌細(xì)胞死亡和纖維化均顯著增加。與野生型小鼠比較，MyD88-/-小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞肥大、凋亡、炎癥、oxidized-CaMKⅡ的表達(dá)、梗死后病死率均顯著減少。原因是MyD88-/- 小鼠核因子κB激活存在缺陷[29] 。這些證據(jù)表明，Toll樣受體/MyD88這條經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路氧化激活CaMKⅡ，oxidized-CaMKⅡ活化NF-κB參與了梗死后的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的CaMKⅡ蛋白質(zhì)翻譯后修飾產(chǎn)物，oxidized- CaMKⅡ參與了諸多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。oxidized-CaMKⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和腎上腺素能信號(hào)系統(tǒng)的重要效益產(chǎn)物，反映器質(zhì)性心臟病的氧化應(yīng)激壓力。在心肌細(xì)胞中，RAAS系統(tǒng)既氧化激活CaMKⅡ，又磷酸化激活CaMKⅡ。β-腎上腺素能受體信號(hào)通路主要磷酸化激活CaMKⅡ。oxidized- CaMKⅡ參與了與心律失常相關(guān)的病理性心肌細(xì)胞記憶，是病態(tài)竇房結(jié)綜合征患者的生物學(xué)標(biāo)志物。oxidized-CaMKⅡ參與心肌缺血-再灌注損傷，心肌梗死后的炎癥反應(yīng)，以及心肌梗死后醛固酮系統(tǒng)誘導(dǎo)的心室重構(gòu)。持續(xù)的氧化應(yīng)激壓力通過NADPH氧化酶依賴性ROS氧化激活CaMKⅡ，影響I_Na失活，擴(kuò)大I_Ca，L，觸發(fā)EADs 和DADs，導(dǎo)致器質(zhì)性心臟病患者發(fā)生致命性心律失常。

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（收稿日期：2014-10-08）

（本文編輯：鄭辛甜）

P335-338