高通量細(xì)菌核酸提取儀設(shè)計(jì)

戴春喜　周超

摘要：核酸提取儀是涉及生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)領(lǐng)域中用于核酸提取的一種裝置， 傳統(tǒng)的核酸制備方式是將待測樣品加入含有化學(xué)試劑或裂解酶的試劑中，通過化學(xué)反應(yīng)達(dá)到核酸樣本的制備。這種方法有毒害物質(zhì)，存在樣品制備耗時(shí)大，效率低，處理的樣品少，有交叉污染等諸多缺點(diǎn)，逐漸難以滿足高速、大批量的核酸提取要求。本設(shè)計(jì)提出了一種通過物理震蕩的方式結(jié)合某種試劑實(shí)現(xiàn)樣品裂解的核酸提取裝置。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌核酸提取；樣品制備；核酸提取儀

1.前言

基因測序、分子診斷、生物醫(yī)藥等生命科學(xué)需要大量的樣品制備，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，目前臨床診斷及生物實(shí)驗(yàn)處理的樣品數(shù)量往往很大。傳統(tǒng)的核酸制備方式是將待測樣品加入含有化學(xué)試劑或裂解酶的試劑中，通過化學(xué)反應(yīng)達(dá)到核酸樣本的制備。這種方法有毒害物質(zhì)，存在樣品制備耗時(shí)大，效率低，處理的樣品少，有交叉污染等諸多缺點(diǎn)，逐漸難以滿足高速、大批量的核酸提取要求?，F(xiàn)有的核酸提取儀單次處理的樣品數(shù)量較少，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價(jià)格昂貴，提取耗時(shí)長，常常需要吸附、洗滌、洗脫等繁瑣操作步驟。

針對(duì)上述問題，本設(shè)計(jì)提供了一種許多樣品可以同時(shí)做振蕩操作，且用時(shí)少，效率高，一致性好的核酸提取裝置。

2.設(shè)計(jì)方案

2.1設(shè)計(jì)方案描述

本設(shè)計(jì)采用以下方案：

它包括振蕩器組件，連接所述振蕩器組件的樣品架組件，所述振蕩器組件的控制系統(tǒng)，以及安裝所述振蕩器組件和控制系統(tǒng)的機(jī)座；所述振蕩器組件包括電機(jī)，連接在所述電機(jī)輸出軸上的偏心套，連接在所述偏心套的偏心軸上的軸承，以及連接在所述軸承外圈的軸承套，所述軸承套頂部具有一與其一體的螺紋套，所述電機(jī)的固定板上設(shè)置一止轉(zhuǎn)套，所述止轉(zhuǎn)套與軸承套之間連接有若干拉伸彈簧；所述樣品架組件包含試管架，插設(shè)在所述試管架上的若干樣品管，設(shè)置在所述樣品管頂部的一頂緊板，所述頂緊板的頂部連接一鎖緊蓋，所述鎖緊蓋頂部連接一鎖緊手柄，所述鎖緊手柄的底部螺桿穿過所述鎖緊蓋、頂緊板、試管架，固定在所述振蕩器組件的螺紋套內(nèi)，所述頂緊板與所述試管架之間彈性連接。

所述振蕩器組件中的偏心套上，與所述電機(jī)輸出軸連接的偏心孔和一體設(shè)置的偏心軸的軸線，均位于所述偏心套中心線的一側(cè)，且二者之間間隔一距離。

所述頂緊板與所述試管架之間的彈性連接，包括固定連接并凸伸出所述頂緊板底部的兩對(duì)稱的端部具有凸緣的連接銷，對(duì)應(yīng)設(shè)置在所述試管架上的兩漸縮的弧形孔，套設(shè)在所述鎖緊手柄螺桿上的彈簧和彈簧調(diào)節(jié)片，所述兩連接銷穿過所述兩弧形孔的大頭端，經(jīng)所述鎖緊手柄轉(zhuǎn)動(dòng)后，定位在所述兩弧形孔的銷頭端。

2.2附圖說明

2.3具體實(shí)施方式說明

結(jié)合附圖對(duì)本設(shè)計(jì)進(jìn)行詳細(xì)說明。

如圖1示，本設(shè)計(jì)包括振蕩器組件10，樣品架組件20，控制系統(tǒng)50，安裝振蕩器組件10和控制系統(tǒng)50的機(jī)座60。

如圖2、圖3示，本設(shè)計(jì)的振蕩器組件10包括電機(jī)11，偏心套12、軸承套14，止轉(zhuǎn)套15和拉伸彈簧16。偏心套12上具有一與電機(jī)11連接的偏心孔，并通過螺釘固定在電機(jī)11的輸出軸上。偏心套12的頂部具有一與其一體的偏心軸17，偏心軸17與偏心孔均靠近偏心套12中心線的一側(cè)，且二者之間保持一偏心距離，這樣當(dāng)偏心套12在電機(jī)11的帶動(dòng)下做偏心轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，偏心套12中心線的另一端可以起到配重的作用。偏心軸17固定連接軸承13的內(nèi)圈，軸承13的外圈固定連接軸承套14，軸承套14的上部設(shè)置有一與其一體的螺紋套18，螺紋套18具有內(nèi)螺紋，用于連接樣品架組件20。止轉(zhuǎn)套15連接在電機(jī)固定板19上，四根拉伸彈簧16的一端分別固定連接止轉(zhuǎn)套15，四根拉伸彈簧16的另一端分別固定連接軸承套14上部的邊緣，從而使軸承套14受到一柔性的拉伸力，使其只能隨偏心軸17沿電機(jī)輸出軸做一“O”型軌跡轉(zhuǎn)動(dòng)，而自身不饒偏心軸17轉(zhuǎn)動(dòng)，即只做公轉(zhuǎn)，不自轉(zhuǎn)。這樣樣品管內(nèi)的樣品始終受到遷移加速度作用，可充分裂解。

如圖4、圖5所示，本設(shè)計(jì)的樣品架組件 20包括試管架21，樣品管22，鎖緊蓋23，頂緊板24和鎖緊手柄25。試管架21上插設(shè)有若干樣品管22，試管架21中部設(shè)置有一中心孔26和兩弧形孔27。

如圖6、圖7所示，鎖緊蓋23中心設(shè)置有中心孔28，中心孔28周圍設(shè)置有兩圈通孔29，在外圈通孔29中包括對(duì)稱設(shè)置的兩臺(tái)階孔30。與鎖緊蓋23對(duì)應(yīng)，在頂緊板24上設(shè)置有中心孔31和通孔32、33和螺孔34。

如圖8、所示，鎖緊手柄25下部的伸出桿上具有一段螺桿35，將螺桿35穿過鎖緊蓋23和定緊板24的中心孔28、31，用螺釘穿過內(nèi)圈的通孔29、33將頂緊板23和鎖緊蓋24固定在鎖緊手柄25上的螺孔36中。在鎖緊蓋23上的一對(duì)臺(tái)階孔30中，用兩螺釘37連接兩個(gè)穿過頂緊板24上通孔32且底部具有凸緣38的連接銷39，再用螺釘40穿過鎖緊蓋23上的通孔29固定在頂緊板24上的螺孔34中；在鎖緊手柄25的螺桿35上套設(shè)一彈簧41，并用螺紋連接一彈簧調(diào)節(jié)片42，然后固定一個(gè)螺母43，再將螺桿35穿過樣品架21的中心孔26，將頂緊板26底部的兩連接銷39上的凸緣38，插入試管架21的兩弧形孔27的大頭端，旋轉(zhuǎn)鎖緊手柄25，便可以將連接銷39旋轉(zhuǎn)到弧形孔27的小頭端定位，使樣品架21和頂緊板24通過彈簧41彈性頂緊，以使樣品管22不可隨意軸向竄動(dòng)；最后將鎖緊手柄25的螺桿35端部擰緊在振蕩器組件10頂部的螺紋套18中，使振蕩器組件10和樣品架組件20固定連接在一起。

本設(shè)計(jì)裝置運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，電機(jī)11的輸出軸帶動(dòng)偏心套12轉(zhuǎn)動(dòng)，偏心套12上的偏心軸17帶動(dòng)軸承套14和其上的樣品組件20繞電機(jī)11的輸出軸做一“O”型軌跡的轉(zhuǎn)動(dòng)。當(dāng)操作完成后，轉(zhuǎn)動(dòng)鎖緊手柄25，便可以使兩連接銷39轉(zhuǎn)動(dòng)至弧形孔27的大頭端，打開鎖緊板24，從樣品架21上取出裂解完成的樣品管22，再換上新的樣品管22后，蓋上頂緊板24，進(jìn)行下一個(gè)周期的操作。

2.4本設(shè)計(jì)方案實(shí)現(xiàn)的創(chuàng)新性及優(yōu)點(diǎn)

本設(shè)計(jì)由于采用以上技術(shù)方案，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：①由于本設(shè)計(jì)同時(shí)可裝載數(shù)十個(gè)樣品管，解決了傳統(tǒng)核酸提取方法的費(fèi)時(shí)、效率底下的問題。②使用本設(shè)計(jì)裝置一批樣品數(shù)量多，特殊的震蕩機(jī)構(gòu)使多樣品管震蕩幅度相同，實(shí)現(xiàn)了多份樣品的均一制備，并且減少了樣品制備過程中的交叉污染。③本設(shè)計(jì)靈敏度高，提取細(xì)菌核酸，取1ul（微升）做PCR（聚合酶鏈反應(yīng)，Polymerase Chain Reaction）， 敏感性為103個(gè)菌/100μl。④本設(shè)計(jì)通用性好，不同生物、不同菌株、不同檢測基因、不同樣品（液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)）、不同試驗(yàn)批次操作步驟相同，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高，管間提取效率相同。⑤本設(shè)計(jì)提取核酸的穩(wěn)定性好，提取的DNA于4℃保存40天和60天后，其檢測靈敏度沒有顯著變化。⑥本設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，安全性好，易于維護(hù)，無需酶和有害化學(xué)試劑。本設(shè)計(jì)可用于提取細(xì)菌類（G+菌，G-菌，分支桿菌）真菌（酵母、白色念珠菌），病毒等微生物核酸包括RNA的提取。

2.5質(zhì)控實(shí)驗(yàn)

物理質(zhì)控

（1）核酸提取管。保持液體澄清且pH8.0；體積不得低于70μl；管內(nèi)觀察必須同時(shí)存在大小玻璃珠。

（2）核酸提取液。保持液體澄清且pH8.0；體積不得低于1ml。

生物質(zhì)控（提取效率質(zhì)控）

從每批產(chǎn)品中，隨機(jī)抽取6個(gè)試劑盒，每個(gè)試劑盒里面隨機(jī)抽取2個(gè)提取管，用于提取下面的系列稀釋菌液，一共得到12管提取液。進(jìn)行PCR電泳。要求靈敏度必須達(dá)到敏感性為103個(gè)菌/100μl為合格。

實(shí)驗(yàn)方法具體如下：

培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)株腸球菌WHO20菌株，10倍系列稀釋菌液，取100μl提取核酸，對(duì)慶大霉素耐藥基因aac做擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，使用普通PCR體系及擴(kuò)增程序即可。并進(jìn)行電泳試驗(yàn)（細(xì)菌原液109個(gè)/ml） ：儀器靈敏性和穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示了我們能夠穩(wěn)定達(dá)到的高提取效率水平。提取的DNA于4℃保存40天和60天后，其檢測靈敏度沒有顯著變化。

3.結(jié)束語

高通量的核酸提取設(shè)備可以快速、大量的完成核酸提取，把實(shí)驗(yàn)人員從繁重的傳統(tǒng)手工操作中解脫出來，同時(shí)具備樣品均一性好，提取效率高，安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)踐證明此設(shè)計(jì)可高效快速提取樣品核酸，適用范圍廣：可提取細(xì)菌，多數(shù)真菌，病毒等樣本；操作極為簡便，僅需兩步操作，不超過10分鐘即可完成提取。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，此方法核酸提取效率可穩(wěn)定在高水平，重復(fù)性好，不同批次的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高，管間提取效率均相同；通用性好，不同生物、不同菌株、不同檢測基因、不同樣品（液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)）、不同實(shí)驗(yàn)批次操作步驟相同。

參考文獻(xiàn)：

[1]譯者：（美國）M.謝納著，張亮.《生物芯片分析》，科學(xué)出版社，2005-10

[2]聞邦椿.《機(jī)械設(shè)計(jì)手冊》.機(jī)械工業(yè)出版社，2010-01

作者簡介：

戴春喜（1980.2—）男，碩士，高級(jí)工程師，北京人，山東瑞安泰醫(yī)療技術(shù)有限公司，從事機(jī)械設(shè)計(jì)工作。