大豆蛋白飲料中大豆蛋白定量方法研究

摘要[目的]建立基于競爭酶聯(lián)免疫分析（ELISA）的大豆蛋白飲料中大豆蛋白定量方法。[方法]以變性的大豆球蛋白和β伴球蛋白為抗原，分別制備抗這2種蛋白的多克隆抗體，構(gòu)建競爭ELISA方法。分析了9個(gè)品系的大豆球蛋白、β伴球蛋白、可溶蛋白的含量?；诖蠖骨虻鞍着c伴球蛋白含量之和與可溶蛋白的比例關(guān)系，得出了植物蛋白飲料中大豆蛋白含量的計(jì)算方法。[結(jié)果]該方法的線性范圍均為2.0～80 μg/ml（R2=0.99），樣品前處理使用含有0.1% 二硫蘇糖醇（DTT）的7 mol/L尿素作為提取液。大豆球蛋白與伴球蛋白含量之和除以系數(shù)0.682可換算得到蛋白飲料中大豆蛋白含量，方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<12%。[結(jié)論] 研究可為其他熱加工食品的蛋白特異性定量提供參考。

關(guān)鍵詞大豆；大豆蛋白；ELISA；定量

中圖分類號S509.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）21-245-04

大豆蛋白含有多種氨基酸，尤其是含有人體所必需的8種氨基酸，是一種全價(jià)的蛋白質(zhì)[1]。在我國，自古以來，大豆都是人類飲食中的重要食品。近年來，大豆蛋白飲料，因其味美、營養(yǎng)、低膽固醇越來越受到消費(fèi)者的喜愛。大豆蛋白飲料包括豆?jié){、液態(tài)豆奶等品種。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 16322-2003《植物蛋白飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，植物蛋白飲料中的蛋白質(zhì)含量應(yīng)不低于5 g/L。由于技術(shù)所限，目前只能依據(jù)凱氏定氮法對其總蛋白進(jìn)行定量，三聚氰胺事件給依賴這一傳統(tǒng)技術(shù)手段進(jìn)行蛋白檢測的方法敲響了警鐘。雖然現(xiàn)在對三聚氰胺的控制卓有成效，但是對非法添加物的監(jiān)控仍然是針對已知的、具體的物質(zhì)進(jìn)行檢測。合成化學(xué)的飛速發(fā)展導(dǎo)致可以冒充蛋白質(zhì)的物質(zhì)眾多，制假者的手段也在不斷翻新，假如利用其他物質(zhì)冒充蛋白，現(xiàn)有技術(shù)很難發(fā)現(xiàn)。因此迫切需要研究更加特異性的大豆蛋白定量方法，從根本上控制大豆蛋白飲料的非法添加隱患。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，一些研究發(fā)現(xiàn)，組織中存在一些蛋白，其與總蛋白的比例不會(huì)因物種的品系或產(chǎn)地不同而產(chǎn)生較大的變化，可作為蛋白定量標(biāo)志物[2-3]。通過對這些蛋白定量標(biāo)識物的測定即可推算出物種的總蛋白含量，實(shí)現(xiàn)物種蛋白的特異性定量。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑和樣品。

大豆球蛋白、大豆β伴球蛋白、α乳球蛋白、β乳球蛋白、酪蛋白、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑、辣根過氧化物酶、卵白蛋白、牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇（DTT），Sigma公司；醛基活化的辣根過氧化物酶，Thermo公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。ELISA反應(yīng)檢測用試液配制見參考文獻(xiàn)[4]。豆奶粉、豆粉、豆?jié){、液態(tài)豆奶，隨機(jī)采購于深圳市場。

1.1.2主要儀器。

酶標(biāo)儀為iMARK，BIORAD公司；超聲破碎儀為Uibracell VCX750，Sonics and Materials公司；蛋白測定儀為Kjeltec 8400，F(xiàn)oss公司；高速離心機(jī)；精密電子天平等。

1.2方法

1.2.1抗體的制備。

將大豆球蛋白和大豆β伴球蛋白分別溶解于0.1% DTT的7 mol/L尿素中進(jìn)行變性處理，濃度為10 mg/ml，免疫前使用0.01 mol/L pH 7.4 PBS稀釋10倍。皮下免疫新西蘭大白兔，每只劑量0.1 ml。多克隆抗體制備方法參考冷泉港實(shí)驗(yàn)室手冊的方法進(jìn)行[5]，使用硫酸銨沉淀法純化抗體[6]。

1.2.2酶標(biāo)抗體的制備。

使用辣根過氧化物酶分別標(biāo)記抗體。將0.3 mg純化的抗體溶解于0.1 mol/L pH 9.5的碳酸鹽緩沖液中。加入0.1 ml 10 mg/ml的活化醛基的辣根過氧化物酶溶液后4 ℃反應(yīng)過夜。加入30 μl 0.2 mol/L的賴氨酸終止反應(yīng)，透析純化后備用。

1.2.3ELISA標(biāo)準(zhǔn)品。

分別配制10 mg/ml的大豆球蛋白和β伴球蛋白的PBS溶液，沸水浴加熱30 min。加入固體DTT和尿素，使其形成0.1% DTT的7 mol/L尿素溶液，超聲處理10 min，使用PBS稀釋，分別配制成200、80、40、8、4、2、0.8、02 μg/ml。

1.2.4競爭ELISA操作。

每孔加大豆球蛋白或大豆β伴球蛋白包被液100 μl 4 ℃孵育過夜。第2天倒掉包被液，用洗滌液洗一遍，每孔再加200 μl封閉液，37 ℃孵育3 h，倒掉封閉液。每孔加50 μl酶標(biāo)單克隆抗體和50 μl樣品（或?yàn)榈鞍讟?biāo)準(zhǔn)溶液），陰性對照孔用PBS代替。37 ℃反應(yīng)0.5 h，然后用PBST洗3次。加底物液，37 ℃反應(yīng)10 min，H2SO4終止反應(yīng)后上酶標(biāo)儀讀數(shù)。以卵白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，B/B0為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（B為樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，B0為空白溶液的吸光度值）。使用Origin 7.5 四參數(shù)擬合計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50。同時(shí)，采用棋盤法試驗(yàn)優(yōu)化包被抗原和酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.5ELISA檢測抗體特異性。

采用其他植物蛋白飲料中常見的蛋白作考察對象，采用競爭ELISA檢測抗體與其之間的交叉反應(yīng)。

1.2.6大豆可溶蛋白的提取。

大豆可溶蛋白的提取采用劉海順等報(bào)道的方法并略有改進(jìn)[7]。干大豆于40 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)繼續(xù)干燥48 h后，使用錘式旋風(fēng)磨進(jìn)行細(xì)粉碎，使90%以上通過60目篩。稱取大豆粉10 g，于40 ℃恒溫條件下，使用1 000 ml蒸餾水，分5次超聲提取大豆蛋白，每次提取時(shí)間為1 h。5次提取的提取液合并后使用GB 5009.5-2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中規(guī)定的凱氏定氮法測定可溶蛋白含量，使用“1.2.4”建立的酶聯(lián)免疫法測定大豆球蛋白和β大豆伴球蛋白含量。其他用于交叉反應(yīng)測試的堅(jiān)果和豆類可溶蛋白均使用該方法提取。

1.2.7檢測樣品的前處理。

固體蛋白飲料采用含0.1%DTT的7 mol/L尿素作為樣抽提液體提取其中的蛋白成分。稱取5 g均質(zhì)食品樣品，使用樣品提取液定容至100 ml。超聲提取10 min后離心。上清液使用0.01 mol/L pH 7.4 PBS適當(dāng)稀釋至ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍（為避免變性劑和還原劑對ELISA的影響，至少需稀釋100倍）。液體蛋白飲料直接加入DTT和尿素，使其終濃度分別為0.1%和7 mol/L。后續(xù)處理步驟同固體蛋白飲料。

1.2.8樣品模擬熱加工試驗(yàn)。

將“1.2.6”中制備的大豆蛋白提取液分別于100、115、125 ℃加熱15 min。。使用凱氏定氮法測定可溶蛋白含量，酶聯(lián)免疫法測定大豆球蛋白和大豆β伴球蛋白含量，前處理方法參照“1.2.7”中液體蛋白飲料前處理步驟。

43卷21期張世偉等大豆蛋白飲料中大豆蛋白定量方法研究

2結(jié)果與分析

2.1ELISA方法

依據(jù)蛋白定量標(biāo)示物對特定物種所含的蛋白進(jìn)行定量是近年來蛋白定量的一個(gè)重要方向。蛋白定量標(biāo)示物的選擇關(guān)系著物種蛋白特異性定量的靈敏度和準(zhǔn)確性。該蛋白定量標(biāo)示物必須為組織中的高豐度蛋白，并且能溶于水，其與總蛋白的比例不因物種品系和產(chǎn)地的不同而變化。由于大豆是人類可食用蛋白質(zhì)的重要來源之一，研究較為透徹。大豆球蛋白和β伴球蛋白是大豆中最高豐度的2種蛋白[8]。該研究分別建立了大豆球蛋白和β伴球蛋白的ELISA方法。在ELISA方法中，雙抗夾心法是檢測大分子蛋白的經(jīng)典反應(yīng)模式。其使用2個(gè)抗體識別1個(gè)抗原，具有特異性高、反應(yīng)靈敏等優(yōu)勢。但是，雙抗夾心需要一個(gè)蛋白分子提供2個(gè)抗體識別位點(diǎn)。然而在熱處理過程中，部分蛋白發(fā)生水解使其不能同時(shí)被2個(gè)抗體結(jié)合。競爭法中1個(gè)抗原分子只結(jié)合1個(gè)抗體，即使被水解，只要抗原決定簇不受破壞仍然可被抗體識別，可以較好地應(yīng)用于熱處理蛋白的檢測。因此，該研究基于競爭法，建立了檢測大豆球蛋白和β伴球蛋白的ELISA方法。

抗體的制備是ELISA方法建立的關(guān)鍵點(diǎn)。由于大豆球蛋白和β伴球蛋白是重要的過敏原，商品化的抗體很多。該研究嘗試使用商品化的抗體建立檢測熱加工大豆蛋白的ELISA方法，但是效果不理想。原因在于，目前商品化的大豆蛋白抗體一般以天然的蛋白為抗原，而熱加工食品由于蛋白的變性作用與天然蛋白產(chǎn)生構(gòu)象差異，不能等同被抗體識別，定量結(jié)果會(huì)隨著熱加工程度的不同產(chǎn)生巨大的差異[9-10]。因此該研究采用經(jīng)過還原劑和變性劑處理過的大豆球蛋白和β伴球蛋白作為抗原，分別制備了抗這2種蛋白的多克隆抗體，并使用變性處理的蛋白建立ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，這2種抗體檢測大豆球蛋白和β伴球蛋白的IC50分別為10.6和 14.3 μg/ml，線性范圍均為2.0～80 μg/ml（R2=0.99）。

2.2抗體的交叉反應(yīng)

采用競爭ELISA 方法評估上述2種抗體對幾種食品中常見蛋白和干擾物的交叉反應(yīng)。由表1可知，該方法特異性良好，對食品中幾種常見的蛋白、干擾物無交叉反應(yīng)，不易出現(xiàn)結(jié)果誤判。

2.3食品中大豆蛋白的計(jì)算方法

基于蛋白定量標(biāo)示物推算該物種總蛋白的前提是定量標(biāo)示物和總蛋白的比例不因物種的品系和產(chǎn)地而顯著不同。雖然大豆球蛋白和β伴球蛋白的含量已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，但是基于的大豆樣品不同、產(chǎn)地不同、測定方法不同，數(shù)值差異較大[11-15]。因此該研究采集了來自我國和美國的9個(gè)品系的大豆樣品，以確定蛋白定量標(biāo)志物。其中GTS4032為美國孟山都公司的轉(zhuǎn)基因大豆。因?yàn)橹参锏鞍罪嬃现械脑系鞍拙鶠榭扇艿鞍祝虼嗽撗芯恐饕芯康鞍锥繕?biāo)示物和可溶蛋白的比值。通過建立的ELISA方法分析其大豆球蛋白和β伴球蛋白含量，通過凱氏定氮法測定其可溶蛋白含量。如表2所示，這2個(gè)蛋白在這9個(gè)品系中的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.91%和3.17%，而2個(gè)蛋白的總量與可溶蛋白的比值最為恒定，平均值為682%，相對偏差僅為2.30%。因此，為了確保計(jì)算的準(zhǔn)確性，該研究采用大豆球蛋白和β伴球蛋白共同作為定量標(biāo)示物，植物蛋白飲料中大豆蛋白含量可使用以下公式進(jìn)行計(jì)算：

C大豆蛋白含量=[C大豆球蛋白含量+C大豆β-伴球蛋白含量]/0.682，單位均為mg/g（固體）或mg/ml（液體）。

2.4樣品提取液的選擇

提取液配方關(guān)系著ELISA定量的準(zhǔn)確性。特別對于熱加工食品，由于蛋白受熱發(fā)生水解、變性、聚積等作用，提取液的選擇就更為重要。該研究選用凱氏定氮法測得的蛋白含量為3.18 mg/ml的南農(nóng)996大豆水提取物作為試驗(yàn)樣本，以豆?jié){的加工工藝（100 ℃），液體大豆蛋白飲料滅菌工藝（115 ℃或121 ℃）為模擬熱加工條件，評估不同提取液的提取效果。ELISA方法最常用的前處理提取溶液為非變性緩沖液，如Tris緩沖液、PBS緩沖液等。該研究分別考察了3種不同pH的非變性緩沖液，如表3所示，非變性提取液提取效果較差。其原因在于，該研究采用的是變性抗原免疫獲得的多克隆抗體，非變性提取液提取的蛋白抗原決定簇未充分暴露，并且大豆蛋白溶液在熱加工過程中會(huì)產(chǎn)生一定的熱聚集，這些熱聚集蛋白不能溶解于非變性溶液中。據(jù)朱建華等的報(bào)道，大豆球蛋白和伴球蛋白在90 ℃時(shí)即可發(fā)生熱聚集，而高濃度的巰基乙醇和尿素能解離這2種蛋白形成亞基，從而獲得更好的溶解性[16]。DTT和巰基乙醇同為還原劑，但無巰基乙醇的不愉快氣味且還原能力更好，因此該研究使用DTT代替巰基乙醇。如表2所示，雖然與非變性提取液相比，這2種組分均能更好地溶解大豆蛋白，但其提取率仍不理想，特別是對經(jīng)過高溫高壓的大豆蛋白。筆者課題組曾報(bào)了使用含0.1%DTT的7 mol/L尿素提取熱變性雞蛋蛋白的方法[17]。該研究將這2種提取液復(fù)配使用發(fā)現(xiàn)，其提取的大豆蛋白ELISA測定值顯著提高，最為接近凱氏定氮法的測定數(shù)據(jù)。因此此方法前處理采用含有0.1%DTT的7 mol/L尿素作為提取液。

2.5模擬加工樣品測定

該研究將9個(gè)品系的大豆樣品模擬熱加工，通過ELISA測定大豆球蛋白和β伴球蛋白含量，使用“2.2”中給出的公式計(jì)算大豆蛋白含量，并與凱氏定氮法的蛋白定量數(shù)據(jù)相對照，結(jié)果見表4。由表4可知，使用ELISA測定未加熱、100 ℃加熱15 min、115 ℃加熱15 min這3種熱加工方式大豆蛋白含量與凱氏定氮法的偏離度較小，最大偏離度分別為5.2%、4.3%、8.2%。而使用ELISA測定121 ℃加熱15 min時(shí)的大豆蛋白含量與凱氏定氮法偏離較大，最大偏離度可達(dá)14.3%。主要是因?yàn)樵诖藴囟认?，熱變性較為劇烈，導(dǎo)致該研究采用的提取液較難溶解熱聚積的蛋白。但筆者調(diào)查的大豆蛋白飲料生產(chǎn)企業(yè)，為避免蛋白的熱聚集，大多采用UHT滅菌方式，少部分采用該條件滅菌的企業(yè)，均使用了抗蛋白熱聚集乳化劑。這些措施都可以有效地避免蛋白聚集沉淀[18-20]。因此該研究所提供的大豆蛋白測定方法適用于熱加工的大豆蛋白飲料測定。

2.6實(shí)際樣品檢測

該研究從深圳市場隨機(jī)購買豆?jié){、豆奶、速溶豆粉、豆奶粉樣品，采用所建立的ELISA方法和國標(biāo)GB 5009.5-2010規(guī)定的凱氏定氮法進(jìn)行檢測。如表5所示，純大豆蛋白飲料，如豆?jié){和速溶豆粉，和凱氏定氮法的結(jié)果最為相近；豆奶和豆奶粉因?yàn)榧尤肓艘欢康呐Ｄ?，其結(jié)果和凱氏定氮法差異較大。其中2份豆奶樣品雖然凱氏定氮結(jié)果相同，但是ELISA結(jié)果相差大約3倍，說明豆奶2中的大豆含量明顯低于豆奶1。盡管ELISA方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差接近12%，大于凱氏定氮法，然而使用ELISA方法可以清晰展示其中大豆蛋白所占的比例，是一種更為特異的蛋白定量技術(shù)。

3結(jié)論

食品中各原料所含有的營養(yǎng)有所不同，其價(jià)格也相差巨大，使用低價(jià)原料摻偽高價(jià)原料的事件時(shí)有發(fā)生，如核桃露中加入大量的花生，燕窩和雪蛤飲品中加入大量的明膠，雖然傳統(tǒng)的蛋白定量結(jié)果并無異常，但商品的價(jià)值卻大大降低。因此需要研究相應(yīng)的檢測方法對商品的原料用料情況進(jìn)行監(jiān)控。該研究提供的方法可準(zhǔn)確檢測大豆熱加工食品中的大豆球蛋白和β伴球蛋白，并提供了基于這2種蛋白推算蛋白飲料中大豆蛋白的公式，為進(jìn)一步引導(dǎo)廠商在食品外包裝上標(biāo)注特征蛋白含量，更清晰地向消費(fèi)者展示其商品的某些特定原料的含量提供檢測技術(shù)支撐，也為其他熱加工食品的蛋白特異性定量提供了思路。

參考文獻(xiàn)

[1] 許月，朱長甫，石連旋，等.大豆種子貯藏蛋白的研究概況[J].大豆科學(xué)，1998，17（3）：262-264.

[2] AYAKO Y，YUTAKA T，TAKAHIRO N.Enzyme immunoassay for phycocyanin as the main component of spirulina color in foods[J].Biosci Biotech Biochem，1996，60（1）：57-60.

[3] ZHANG S，LAI X，LIU X，et al.Competitive enzymelinked immunoassay for sialoglycoprotein of edible birds nest in food and cosmetics[J].J Agric Food Chem，2012，60：3580-3585.

[4] 韓丹，于夢，吳梅，等.酶聯(lián)免疫吸附分析法測定食品中的蘇丹紅Ⅰ號[J].分析化學(xué)，2007，35（8）：1168-1170.

[5] HARLOW E，LANE D.Antibodies：A laboratory manual [M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988：139-242.

[6] WENGATZ I，STOUTAMIRE D，GEE S J，et al.Development of an enzymelinked immunosorbent assay for the detection of the pyrethroid insecticide fenpropathrin[J].J Agric Food Chem，1998，46：2211-2221.

[7] 劉海順，張志航，胡瑞豐，等.大豆水溶性蛋白測定方法探討[J].糧食儲(chǔ)藏，2011（3）：48-49.

[8] 朱曉東，沈倉良.大豆蛋白質(zhì)的研究[J].中國飼料添加劑，2006（9）：10-12.

[9] SCHARF A，KASEL U，WICHMANN G，et al.Performance of ELISA and PCR methods for the determination of allergens in food：an evaluation of six years of proficiency testing for soy（Glycine max L.） and wheat gluten（Triticum aestivum L.） [J].J Agric Food Chem，2013，61（43）：10261-10272.

[10] FU T J，MAKS N，BANASZEWSKI K.Effect of heat treatment on the quantitative detection of egg protein residues by commercial enzymelinked immunosorbent assay test kits[J].J Agric Food Chem，2010，58：4831-4838.

[11] MARUYAMA N，F(xiàn)UKUDA T，SAKA S，et al.Molecular and structural analysis of electrophoresis variants of soybean seed storage proteins[J].Photochemistry，2003，64（3）：701-708.

[12] MORI T，UTSUMI S，INHABA H，et al.Differences subunit composition of glycinin among soybean cultivars[J].J Agric Food Chem，1981，29：20-23.

[13] 周兵，周瑞寶.大豆球蛋白的性質(zhì)[J].西部糧油科技，1998（4）：39-43.

[14] 胡聲迪，郭金枝，馬曦.大豆β伴大豆球蛋白研究進(jìn)展[J].中國畜牧雜志，2010（5）：65-68.

[15] 司曉霞，王志，霍斐，等.大豆中β伴大豆球蛋白提純方法的優(yōu)化[J].植物研究，2011（4）：397-402.

[16] 朱建華，楊曉泉，陳剛.大豆7S球蛋白和11S球蛋白的研究[J].糧油加工與食品機(jī)械，2003（8）：37-39.

[17] ZHANG S，LAI X，YANG G.Enzymelinked Fab fragment based competitive immunoassay for ovalbumin in hotprocessed food[J].J Immunoass Immunoch，2013，34：393-403.

[18] 陳彥斌，張宏盈，閆慶標(biāo)，等.干法生產(chǎn)UHT豆奶工藝技術(shù)研究及應(yīng)用[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2005（4）：167-169.

[19] 朱秀清，夏劍秋，劉宇峰.我國大豆蛋白制品中存在的問題及對策[J].食品工業(yè)科技，2001（2）：83-85.

[20] 何于飛.豆奶生產(chǎn)工藝研究[J].山西食品工業(yè)，2002（4）：30-32.