具有拮抗作用的石榴內(nèi)生菌的分離與鑒定

李婭梅等

摘要[目的]篩選對石榴枯萎病菌具有拮抗作用的內(nèi)生生防菌。[方法]從采自云南蒙自的石榴葉片中分離并獲得5株內(nèi)生拮抗菌，通過測定其對甘薯長喙殼（Ceratocystis fimbriata）的抑菌能力篩選出1株具有高效拮抗作用的生防菌株Y2，對其進(jìn)行抑菌譜測定及鑒定。[結(jié)果]經(jīng)生理生化和16S rDNA序列測定表明Y2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為石榴枯萎病的防治提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞石榴；內(nèi)生菌；拮抗作用；分離與鑒定

中圖分類號S436.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）21-125-02

石榴作為一種新興高檔水果，近年來在我國發(fā)展較快。云南省蒙自縣石榴連片種植面積達(dá)0.63萬hm2，居全國前列。石榴枯萎病是我國一種新的果樹病害。病害初期癥狀表現(xiàn)為少數(shù)枝條上葉片發(fā)黃萎蔫，隨后根部和樹主干木質(zhì)部變褐，并且其橫切面木質(zhì)部呈現(xiàn)放射狀黑褐色壞死，多數(shù)石榴樹在21～28 d內(nèi)全株發(fā)病死亡，生長10年以上石榴樹的發(fā)病率（6.0%）高于生長 1～5 年的石榴樹（1.0%）。該病害由子囊菌亞門長喙殼科長喙殼屬的甘薯長喙殼（Ceratocystis fimbriata）引起，被當(dāng)?shù)毓r(nóng)稱為石榴的“癌癥”。該病害自1999年零星發(fā)生后逐年加重，造成石榴產(chǎn)業(yè)的毀滅性損失。

目前石榴枯萎病在國內(nèi)僅云南省有發(fā)現(xiàn)，研究者對該病害的研究報(bào)道較少，黃瓊等于 2003 年首次報(bào)道了石榴枯萎病害在我國的發(fā)生。筆者從石榴中分離并鑒定了對石榴枯萎病菌有拮抗作用的內(nèi)生生防菌，以期為石榴枯萎病的防治提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物。試驗(yàn)材料為取自云南省蒙自市甲村的石榴葉。

1.1.2供試菌株。

以甘薯長喙殼作為供試病原菌。水稻稻瘟菌（Magnaporthe grisea）、玉米彎孢彎霉葉斑病菌（Curvularia lunata）、康乃馨枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.Dianthi）、石榴枯萎病菌（Ceratocystis fimbriata）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）、蘋果斑點(diǎn)病菌（Alternaria alternate f.sp.Mali）、煙草赤星病菌（Alternaria alternate）、魔芋基腐病菌（Alternaia）、三七根腐病菌（Fusarium solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、甘蔗黑腐病菌（Ceratocystis adiposum）11種供試病原菌均由玉溪師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1石榴內(nèi)生菌的分離。參照高玲玲等的方法對石榴葉進(jìn)行石榴內(nèi)生菌的分離。

1.2.2具有抑制作用的細(xì)菌篩選。

以甘薯長喙殼作為供試病原菌，采用抑菌圈法及平板對峙方法篩選具有抑制作用的細(xì)菌，并計(jì)算其生長抑制率。

抑制率=（dCK-dB）/dCK×100%

式中，dCK表示對照病原菌菌落直徑；dB表示處理病原菌菌落直徑。

1.2.3拮抗菌株抑菌譜測定。

以水稻稻瘟菌、玉米彎孢彎霉葉斑病菌、康乃馨枯萎病菌、石榴枯萎病菌、小麥全蝕病菌、蘋果斑點(diǎn)病菌、煙草赤星病菌、魔芋基腐病菌、三七根腐病菌、番茄灰霉病菌、甘蔗黑腐病菌為供試病原菌。采用對峙培養(yǎng)法，以不接種目的細(xì)菌作為對照，于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，5 d后測定病原菌的菌落直徑，計(jì)算其生長抑制率。

1.2.4菌株的鑒定。

1.2.4.1生理生化試驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[4]對菌株進(jìn)行生理生化特征試驗(yàn)。

1.2.4.216S rDNA基因片段序列測定。參照Weisburg等的方法擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA片段。采用細(xì)菌通用引物27F（5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′）和1525R（5′AAGGAGGTGWTCCARCC3′），預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 500 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后回收、純化、測序。

2結(jié)果與分析

2.1石榴內(nèi)生菌的分離結(jié)果

將表面消毒后的石榴葉片研磨，懸液涂布在LB培養(yǎng)基上，分離得到23株石榴內(nèi)生菌。

2.2抑制細(xì)菌的篩選及其抑制作用的檢測結(jié)果

為確定分離得到的23株內(nèi)生細(xì)菌對石榴枯萎病菌的抑菌效果，利用甘薯長喙殼進(jìn)行抑菌測定，結(jié)果表明其中5株內(nèi)生菌具有抑菌作用，其抑制率都在50%以上，分別命名為Y1、Y2、Y3、Y4和Y5。其中，Y2菌株對甘薯長喙殼病菌抑制作用最強(qiáng)，抑制率為82.4%（表1）。

2.3Y2菌株抑菌譜的測定結(jié)果

通過對11個(gè)真菌菌株的抑制作用來看（表2），菌株Y2對病原菌具有一定的抑制作用，它不僅對重大氣傳病害水稻稻瘟病菌有很好的抑制作用，而且對番茄枯萎病菌、小麥全蝕病菌、石榴枯萎病菌也有很好的抑制作用。這些病原菌包括半知菌亞門的鐮刀菌屬（Fusarium）、子囊菌亞門的長喙殼屬（Ceratocystis）以及半知菌亞門的葡萄孢屬（Botrytis）。

2.4Y2菌株的鑒定

2.4.1生理生化鑒定結(jié)果。

對抑菌效果最好的菌株Y2進(jìn)行生理生化測定，結(jié)果表明菌株Y2各項(xiàng)指標(biāo)均為陽性（表3）。

2.4.216S rDNA基因片段序列測定結(jié)果。利用16S rDNA基因片段序列測定，測定結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，菌株Y2與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（AB201120.1）有99%的相似性（圖1）。結(jié)合生理生化鑒定和16S rDNA測定結(jié)果可知，菌株Y2屬于枯草芽孢桿菌。

3結(jié)論與討論

石榴枯萎病是我國一種新的植物病害，其病原菌甘薯長喙殼是導(dǎo)致農(nóng)作物發(fā)生病害的重要病原菌。與其他研究不同，毛忠順等研究了 26 種化學(xué)殺菌劑對石榴枯萎病菌的抑制作用。湯東生等報(bào)道大蒜根系分泌物及紫莖澤蘭提取物對甘薯長喙殼及土壤中枯草芽孢桿菌的影響。該研究從石榴葉片中分離內(nèi)生菌對該病害進(jìn)行防治，因?yàn)閮?nèi)生細(xì)菌存在于植物體內(nèi)，生存環(huán)境穩(wěn)定，不易受到外界環(huán)境的影響，在生物防治病害中比葉際、根際的細(xì)菌具有更大的潛力。該研究首次從石榴葉中分離到具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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