重組A型FMDV VP1基因乳酸桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在大腸桿菌BL21中的表達(dá)

王淼等

摘要

[目的]構(gòu)建FMDV乳酸桿菌穿梭表達(dá)載體。[方法]從A型FMDV中克隆出VP1基因后，根據(jù)乳酸桿菌密碼子偏好性對(duì)VP1進(jìn)行優(yōu)化，與表達(dá)載體pSIP411進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α中篩選出陽(yáng)性克隆菌，重組質(zhì)粒酶切和PCR鑒定成功后再轉(zhuǎn)化到BL21中，采用桿菌肽進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。[結(jié)果]表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE和Western blottmy 檢測(cè)在24 kD處有明顯的條帶，證明VP1pSIP411重組表達(dá)載體構(gòu)建成功并在BL21中成功表達(dá)。[結(jié)論]為后續(xù)乳酸桿菌表達(dá)VP1蛋白研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞口蹄疫病毒；VP1；pSIP；乳酸菌；大腸桿菌

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）21-025-03

口蹄疫（FootandMouth Disease，F(xiàn)MD）是一種高度傳染性和經(jīng)濟(jì)破壞性的家畜疫病，能夠引起家畜生產(chǎn)性能降低，患病仔畜高死亡率，對(duì)畜牧行業(yè)造成巨大損失。除對(duì)動(dòng)物貿(mào)易的擾動(dòng)外，F(xiàn)MD的暴發(fā)還會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)影響，包括對(duì)飼料行業(yè)、獸藥行業(yè)和旅游相關(guān)產(chǎn)業(yè)的破壞。尤其重要的是，它制約了發(fā)展中國(guó)家的畜牧業(yè)發(fā)展，特別對(duì)無(wú)FMD病原的國(guó)家和地區(qū)能夠造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如2001年荷蘭和英國(guó)、2007年英國(guó)暴發(fā)的FMD造成的慘重?fù)p失[1]。

FMD的病原是口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus， FMDV），是單鏈正義RNA病毒，屬于微小RNA病毒科口蹄疫病毒屬。病毒基因組全長(zhǎng)約 8.5 kb，有 7 個(gè)血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3（即南非1、2、3型）和Asia1（亞洲1型），型間無(wú)交叉保護(hù)。其開(kāi)放閱讀框由 L 基因、P1 結(jié)構(gòu)蛋白基因（包括VP4、VP2、VP3、VP1基因）、P2非結(jié)構(gòu)蛋白基因（包括2A、2B、2C基因）和P3非結(jié)構(gòu)蛋白基因（3A、3B、3C、3D基因）組成。其中，VP1蛋白帶有誘導(dǎo)FMD免疫反應(yīng)的關(guān)鍵表位，包括VP1的141～160，200～213和21～40位氨基酸。VP1基因全長(zhǎng)636 nt，是編碼FMDVVP1蛋白的免疫原性基因。圍繞VP1分子，目前研究較熱的FMD基因工程疫苗包括亞單位疫苗、可飼疫苗、蛋白質(zhì)載體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗和核酸疫苗等[2-3]。

pSIP表達(dá)系統(tǒng)是目前研究最為深入、機(jī)理最為清楚、使用最為廣泛的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)之一，能很好地表達(dá)外源性抗原，且以乳酸桿菌作為外源保護(hù)性抗原基因的受體菌株，可將乳酸菌的益生作用和表達(dá)外源功能抗原基因的特異性免疫功能相結(jié)合，最大程度地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[4]。因此，構(gòu)建重組FMDV VP1基因乳酸桿菌表達(dá)載體，是研究乳酸桿菌活載體疫苗的前體和保障。該試驗(yàn)旨在為后續(xù)乳酸桿菌表達(dá)VP1蛋白研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1毒株、菌株和載體

乳酸桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pSIP411由挪威Nofima研究所的Lars Axelsson教授惠贈(zèng)，大腸桿菌DH5α和BL21購(gòu)自于TaKaRa公司，A型FMDV和豬FMDV陽(yáng)性血清為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑

T4 DNA連接酶、Nco I限制性內(nèi)切酶、Xho I 限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB公司；Ex Taq DNA 聚合酶、DNA marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；紅霉素購(gòu)自amresco公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購(gòu)自Millipore公司；HRP標(biāo)記山羊抗豬IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；革蘭氏陰性菌質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海捷瑞公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1

A型FMDV總RNA提取。 取于-70 ℃保存的豬水泡皮毒0.1 g，無(wú)菌條件下置于研缽中剪碎，加入適量石英砂后邊研磨邊加DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，研磨至無(wú)肉眼可見(jiàn)組織塊時(shí)加雙抗，收集后于4 ℃冰箱過(guò)夜。取上清后，按照Qiagen RNeasy Mini Kit （50） 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取。相關(guān)器皿經(jīng)高溫烘烤，試劑、耗材均使用無(wú)RNase產(chǎn)品。

1.3.2

cDNA合成及A型FMDV VP1基因的擴(kuò)增。通過(guò)比對(duì)NCBI上已經(jīng)收錄的A型FMDV VP1基因，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物。

VP1F： 5′GACATGTCCTCCTGCATCT3′；

VP1R： 5′CACAAATGTACAGGGATGGGT3′。

采用TaKaRa PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2.0 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增VP1基因，按照表1程序進(jìn)行。

利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3

A型FMDV VP1基因序列分析。用DNA Star軟件的MegAlign對(duì)VP1基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的參考序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.3.4

目的基因的設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)乳酸菌密碼子偏好對(duì)VP1進(jìn)行優(yōu)化，改造后序列由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成，并克隆到載體pUC57上。并在目的序列兩側(cè)加入限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI的酶切位點(diǎn)。

1.3.5

重組表達(dá)載體的構(gòu)建。將人工合成的含有pUC57VP1的大腸桿菌DH5α涂布于LB固體培養(yǎng)基（含有氨芐青霉素）上進(jìn)行分離培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。12 h后挑取單個(gè)菌落，于5 ml液體LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素），200 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)10～14 h。按照捷瑞公司革蘭氏陰性菌質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

將含有pSIP411陽(yáng)性質(zhì)粒的乳酸球菌MG1363涂布于M17固體培養(yǎng)基（含有10 μg/ml Em）上，恒溫箱37 ℃培養(yǎng)24～36 h。用無(wú)菌小槍頭挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接到5 ml M17液體培養(yǎng)基（含有10 μg/ml Em）中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。按照索萊寶公司革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

采用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI分別對(duì)VP1和pSIP411表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，37 ℃水浴5 h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定成功之后膠回收，回收后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

將回收后的VP1基因和pSIP411載體片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α中進(jìn)行擴(kuò)增，在LB平板上挑取疑似陽(yáng)性重組克隆子，分別接種于5 ml含200 μg/ml紅霉素LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。然后進(jìn)行重組質(zhì)粒提取，將可能的陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

1.3.6

A型FMDV VP1基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá)。

經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定和PCR鑒定均為陽(yáng)性的BL21陽(yáng)性克隆子接種于5 ml （含200 μg/ml Em） LB液體培養(yǎng)基中，2 000 r/min 、37 ℃培養(yǎng)12 h，將上述菌液以1∶100的接種率接種于10 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD值為0.6～08，此時(shí)記為0 h誘導(dǎo)，在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物SppIP （100 ng/ml），之后每隔1 h取菌液至7 h。同樣誘導(dǎo)含有空載體pSIP411的BL21，以此作對(duì)照，分別取2 ml各個(gè)時(shí)間收集的誘導(dǎo)菌液，12 000 r/min離心10 min，棄去上清留菌體沉淀，進(jìn)行SDSPAGE電泳。

1.3.7

Westernblotting分析。SDSPAGE凝膠電泳后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)。用PBS沖洗NC膜3次，然后將膜浸泡于含10%脫脂奶粉的PBST中，37 ℃搖動(dòng)封閉2 h；封閉結(jié)束后PBST清洗NC膜3次，再加入1∶200稀釋的豬抗FMDV A型血清，37 ℃輕搖孵育1 h；取出后用PBST清洗3次，每次15 min；洗完后加入1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗豬IgG，37 ℃輕搖孵育1 h，PBST清洗3次，每次15 min。將膜取出后進(jìn)行ECL顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1VP1序列分析及密碼子優(yōu)化

用DNA Star軟件的MegAlign對(duì)VP1基因測(cè)序結(jié)果與GenBank中的參考序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，該試驗(yàn)所用VP1序列與參考序列（KF450794、HQ116363、HQ268510、HQ116298、EU667455、HQ116293、EU667458、KC588943和F792355）核苷酸一致性均大于91%，其中與2013年廣東茂名所分離的A型毒株核苷酸一致性達(dá)到99.5%（圖1）。

對(duì)野生型VP1基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，調(diào)整的序列占原序列的66.04%，從而使G+C含量由59.53%降低到47.49%，212個(gè)密碼子中，改變140個(gè)密碼子，優(yōu)化密碼子占66.04%。

2.2重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

使用XhoI和NcoI對(duì)含有已優(yōu)化好VP1基因的重組質(zhì)粒pUC57進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR擴(kuò)增片段和酶切片段與預(yù)期大小一致（圖2、3）。將已優(yōu)化的VP1與pSIP411載體16 ℃連接過(guò)夜后，分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取的單個(gè)菌落提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定。通過(guò)電泳鑒定目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。

2.3重組大腸桿菌的SDSPAGE分析

將誘導(dǎo)的重組菌pSIP411VP1BL21和對(duì)照菌pSIP411BL21、未誘導(dǎo)的pSIP411VP1BL21處理進(jìn)行SDSPAGE分析，結(jié)果表明，經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌pSIP411VP1BL21在24 kD處有一條模糊的條帶，而對(duì)照菌pSIP411BL21和未誘導(dǎo)的pSIP411VP1BL21在24 kD處沒(méi)有條帶，說(shuō)明重組菌pSIP411VP1BL21經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)了目的蛋白，但表達(dá)量很低，利用SDSPAGE觀察效果不明顯，進(jìn)一步采用Western blotting進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4重組大腸桿菌的Western blotting結(jié)果鑒定

將誘導(dǎo)的重組菌pSIP411VP1BL21和對(duì)照菌pSIP411BL21、未誘導(dǎo)的pSIP411VP1BL21處理進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果表明經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌pSIP411VP1BL21在24 kD處有一條明顯的條帶，而對(duì)照菌pSIP411BL21和未誘導(dǎo)的pSIP411VP1BL21在24 kD處沒(méi)有條帶，說(shuō)明重組菌pSIP411VP1BL21經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)的目的蛋白具有反應(yīng)原性（圖4）。

2.經(jīng)誘導(dǎo)的質(zhì)粒pSIP411在BL21中的表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)印結(jié)果；3.未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pSIP411VP1在BL21中的表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)印結(jié)果。

3結(jié)論與討論

一直以來(lái)，F(xiàn)MD嚴(yán)重制約世界畜牧業(yè)的發(fā)展，尤其在FMD流行地區(qū)仍將傳統(tǒng)疫苗免疫作為防控的主要措施。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，新型疫苗的研制也在迅猛發(fā)展，但仍處于試驗(yàn)探索階段。將黏膜免疫應(yīng)用在FMD疫苗的研究中也開(kāi)始興起[5]。通過(guò)黏膜免疫途徑將表達(dá)出的FMD VP1與霍亂毒素b亞單位結(jié)合后免疫豬和小鼠，發(fā)現(xiàn)黏膜免疫能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生IgA，以半數(shù)感染量的劑量對(duì)豬攻毒后，保護(hù)率可達(dá)80%[6]。以牛IL6基因作為黏膜分子佐劑，通過(guò)鼻免疫將制備好的吸附殼聚糖PLGA納米/微球載FMD DNA疫苗免疫豚鼠，保護(hù)率可達(dá)60%[7]。將構(gòu)建好的吸附殼聚糖海藻糖載FMD滅活抗原納米微球和吸附殼聚糖載聚乳酸-羥基乙酸共聚物載FMD質(zhì)粒納米微球分別鼻黏膜免疫牛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種納米微球都能誘導(dǎo)局部的鼻黏膜免疫應(yīng)答，且還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[8]。特別是乳酸桿菌活載體疫苗的研究進(jìn)入高速發(fā)展時(shí)期，多種表達(dá)系統(tǒng)被構(gòu)建，多種外源蛋白及抗原被表達(dá)。相信不久的將來(lái)以乳酸桿菌為代表的黏膜免疫新型疫苗的研制會(huì)有質(zhì)的突變，并將給FMD的防控帶來(lái)新的革命。

43卷21期王 淼等重組A型FMDV VP1基因乳酸桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在大腸桿菌BL21中的表達(dá)

FMDV 的VP1基因編碼的蛋白帶有誘導(dǎo)FMD免疫反應(yīng)的關(guān)鍵表位，包括VP1的141～160，200～213和21～40位氨基酸，是編碼FMDVVP蛋白的免疫原性基因。其多肽序列上含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（ArgGlyAsp），即RGD序列，是病毒吸附宿主細(xì)胞所必須的氨基酸序列。通過(guò)基因工程表達(dá)出來(lái)VP1編碼的蛋白能夠誘導(dǎo)與感染性FMD病毒粒子相同的免疫作用。圍繞VP1分子，目前研究較熱的FMD基因工程疫苗包括亞單位疫苗、可飼疫苗、蛋白質(zhì)載體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗和核酸疫苗等。

抗原受體菌株有多種可以選擇，沙門氏菌、李氏桿菌等減毒細(xì)菌常被應(yīng)用于遞呈抗原，但這些菌株卻有毒力返祖的潛在危險(xiǎn)。而乳酸菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)正常存在的菌群，抑制腐敗菌生長(zhǎng)繁殖，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，對(duì)宿主免疫系統(tǒng)有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)功能，進(jìn)入宿主體內(nèi)能適應(yīng)胃部酸性環(huán)境和耐受腸道內(nèi)各種消化酶，能很好地在腸道內(nèi)定植。質(zhì)粒載體的作用是將目的DNA片段運(yùn)送到受體細(xì)胞中，但如果質(zhì)粒到達(dá)宿主洗白基因組內(nèi)，就會(huì)造成基因紊亂、表達(dá)失控、細(xì)胞轉(zhuǎn)型等不良后果。因此要選擇研究透徹的表達(dá)系統(tǒng)[4]。

該試驗(yàn)所用的載體是研究和應(yīng)用較多的pSIP411大腸

桿菌-乳酸桿菌穿梭表達(dá)載體。該研究構(gòu)建的pSIP411VP1重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)，首要的原因是BL21是該載體的表達(dá)菌株，可以鑒定表達(dá)載體構(gòu)建成功并測(cè)定是否具有表達(dá)功能，其次是因?yàn)樵摫磉_(dá)載體在大腸桿菌中的表達(dá)操作程序更容易，通過(guò)從BL21中提取出已鑒定表達(dá)成功的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到乳酸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，操作更具有目的性，為乳酸菌的表達(dá)進(jìn)行了初步性探究，對(duì)重組大腸桿菌-乳酸桿菌穿梭表達(dá)載體pSIP411VP1的表達(dá)效果進(jìn)行初期驗(yàn)證。該表達(dá)系統(tǒng)是乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)，雖然不如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)量高，但該系統(tǒng)誘導(dǎo)的是黏膜免疫，通過(guò)口服給藥，在腸道相關(guān)淋巴組織處被M細(xì)胞遞呈抗原或直接被抗原遞呈細(xì)胞遞呈，產(chǎn)生的是級(jí)聯(lián)反應(yīng)，很少的抗原量就可激發(fā)機(jī)體較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

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