高效纖維素降解真菌的篩選及粗酶活性

許鳳華等

摘要[目的]篩選纖維素酶活力高的纖維素降解真菌，研究其粗酶活性。[方法]從土壤中分離、篩選高效纖維素降解菌，以透明圈試驗(yàn)和濾紙降解試驗(yàn)驗(yàn)證其降解能力，通過(guò)菌落菌絲形態(tài)及rDNA-ITS序列測(cè)序鑒定菌株種屬，通過(guò)改變培養(yǎng)時(shí)間、氮源、裝液量、起始pH及培養(yǎng)溫度5個(gè)因素探討纖維素降解真菌的最適產(chǎn)酶條件。[結(jié)果]得到3株纖維素降解真菌QS2、QS6和QW9，經(jīng)鑒定確定QS2和QS6屬青霉屬（Penicillium），QW9為康寧木霉（Trichoderma koningii）。QS6菌株的FPA酶活和CMC酶活在3個(gè)菌株中均表現(xiàn)活力最高，且最適產(chǎn)酶條件為32 ℃時(shí)氮源為磷酸銨、起始pH 6.0、裝液量100 ml，培養(yǎng)時(shí)間14 d。[結(jié)論]高效纖維素降解真菌粗酶活性的研究為纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞纖維素；真菌；降解能力；FPA酶活；CMC酶活

纖維素（cellulose）是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機(jī)溶劑，是植物細(xì)胞壁的主要成分。纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，占植物界碳含量的50%以上[1]。同時(shí)，纖維素也是一種可再生資源，能被很多種微生物有效轉(zhuǎn)化為單糖，并通過(guò)后續(xù)的加工來(lái)生產(chǎn)乙醇等能源物質(zhì)或其他工業(yè)產(chǎn)品。目前，研究較多的包括木霉（Trichoderma）、曲霉（Aspergillus）、青霉（Penicillium）和纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）等[2]。

纖維素酶是降解纖維素成為葡萄糖單體所需的一組酶的總稱。它不是單種酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系，一般認(rèn)為主要包括內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）、β葡萄糖苷酶三類酶組分[3-4]。纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)及高酶活性的保持一直是纖維素酶在生產(chǎn)應(yīng)用中亟待解決的問(wèn)題。筆者擬從土壤中分離高效纖維素降解菌，篩選出酶活較高的纖維素降解菌，并進(jìn)行分子鑒定，同時(shí)對(duì)其粗酶活性進(jìn)行分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品的采集。采集大慶森林公園多年生針葉林落葉底層的土壤，進(jìn)行纖維素降解真菌的篩選及分離、純化。

1.1.2培養(yǎng)基的配制。篩選培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，CMCNa 2.0 g，蛋白胨1 g，剛果紅0.2 g，瓊脂條20 g，蒸餾水1 000 ml（自然pH），滅菌冷卻；

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，20%土豆汁1 L，pH自然，最后定容到1 000 ml；

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl2 02 g，F(xiàn)eCl3 0.03 g，NaCl 0.1 g，濾紙片20 g，定容到1 000 ml，pH 72～7.5。

1.2方法

1.2.1纖維素降解真菌的篩選及分離、純化。將土壤樣品過(guò)篩，去除雜草、石塊等雜物，稱取3 g土壤樣品，放入無(wú)菌水中充分懸浮，靜置1 h后吸取上清液，進(jìn)行梯度稀釋，分別獲得原液、10-1、10-2、10-3以及10-4的菌液，各取100 μl均勻涂布在篩選培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的不同菌落形態(tài)的真菌在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行反復(fù)三區(qū)劃線，直至得到純化的單菌落，再切下單菌落邊緣部分接種到PDA平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)作為種子。

1.2.2纖維素降解真菌的鑒定。挑取純種的真菌菌絲，加入50 ml液體PDA培養(yǎng)基中，28 ℃，140 r/min振蕩培養(yǎng)約3 d，將菌液中的菌絲過(guò)濾抽干，利用CTAB法進(jìn)行基因組DNA的提取，利用ITS引物擴(kuò)增18S rDNA序列，經(jīng)測(cè)序后在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，確定菌株的近源種。

1.2.3纖維素降解真菌降解能力的測(cè)定。

1.2.3.1透明圈法。在以纖維素為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上接種纖維素降解真菌，28 ℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定菌落直徑（d，cm）和水解圈直徑（D，cm），用HC[5]表示水解能力。

HC =（D/d）2

1.2.3.2濾紙條降解法。將直徑約1 cm纖維素降解真菌菌塊接種于50 ml以濾紙塊為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，80 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)2～7 d后觀察濾紙崩潰情況，反映纖維素降解真菌的降解能力[6]。

1.2.4纖維素降解真菌粗酶活的測(cè)定。

1.2.4.1粗酶液的制備。吸取發(fā)酵液1 ml于10 ml離心管，平衡后于1 000 r/min、4 ℃下離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.4.2酶活力的測(cè)定。采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS法），測(cè)定總纖維素酶活力濾紙酶活（FPAase）和內(nèi)切1，4-葡聚糖酶活力（CMCase）。

1.2.4.3CMC酶活力的測(cè)定。取1.5 ml羧甲基纖維素鈉溶液，加入0.5 ml粗酶液，50 ℃反應(yīng)30 min后加入1.5 ml DNS試劑，沸水浴5 min，立即冷卻，加入1.5 ml蒸餾水，540 nm比色。在上述條件下，1 ml粗酶液在1 min內(nèi)催化底物生成1 pg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）[7]。

1.2.4.4濾紙酶（FPA）活力的測(cè)定。分別稱取0.5 g濾紙小孔于試管內(nèi)，加入檸檬酸緩沖液（pH 5），再加入0.5 ml粗酶液，輕輕搖勻，使濾紙完全浸泡在液體中；在50 ℃溫度下保溫60 min后，同上采用DNS法測(cè)定還原糖[8]。酶活定義同上。酶活通過(guò)以下公式計(jì)算。

酶活（U）=（OD值×0.724 1×0.039 4）×5×1 00030×0.5

式中，5為定容到的體積，單位為ml；1 000為單位換算；30為反應(yīng)時(shí)間，單位為min；0.5為粗酶液體積，單位為ml。

纖維素酶可將地球上最豐富（占全球總生物量80%）、最廉價(jià)的可再生資源纖維素轉(zhuǎn)化為能被直接利用的能源和資源。這是很多科學(xué)工作者一直致力研究的方向。然而，纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)及高酶活性的保持一直是生產(chǎn)上難以徹底解決的問(wèn)題。真菌中的纖維素酶含量較高，活性較強(qiáng)，因此分離纖維素降解真菌，并對(duì)其粗酶活性進(jìn)行研究，能夠?yàn)槔w維素酶液以及獲得較高活性纖維素酶提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1] 李燕紅，趙輔昆.纖維素酶的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2005，17（5）：394-397.

[2] OKSANEN T，PERE J，BUCHERT J，et al.The effect of Trichoderma reesei cellulases and hemicellulases on the paper technical properties of neverdried bleached kraft pulp[J].Cellulose，1997，4：329-339.

[3] 王丹，林建強(qiáng)，張蕭，等.直接生物轉(zhuǎn)化纖維素類資源生產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33（4）：525-529.

[4] ABINOVEH M L，MLNICK M S，BOLOBOVA A V.The structureand mechanism of action of cellulolytic enzymes[J].Biochemistry，2002，67（8）：850-871.

[5] 劉勝貴，嚴(yán)明，鄒娟，等.纖維素降解真菌的篩選及其產(chǎn)酶條件[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011（7）：102-106.

[6] 許玉林，鄭月霞，葉冰瑩，等.一株纖維素降解真菌的篩選及鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（2）：220-227.

[7] ANDO S，ISHIDA H，KOSUGI Y，et al.Hyperthermostable endoglucanase from Pyrococcus horikoshi[J] Appl Environ Microbio，2002，68（1）：430-433.

[8] 錢存柔，黃儀秀.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：北京大學(xué)出版社，1999.

[9] 肖舸，雷芳，喻東，等.一株產(chǎn)纖維素酶綠色木霉的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，4（2）：422-425.

[10] 湯斌，陳阿娜，張慶慶.纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（6）：6-8.

[11] 劉起麗，張建新，徐瑞富，等.纖維素剛果紅培養(yǎng)基篩選產(chǎn)纖維素酶菌株的影響因素研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（5）：279-281.

[12] 陳力宏.纖維素酶在食品發(fā)酵中的應(yīng)用 [J].中國(guó)釀造，1990（5）：2-5.

[13] 胡亞林，冼亮，劉果，等.兩株纖維素降解真菌的分離鑒定及其產(chǎn)纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（4）：425-428.

[14] 張曉炬，李景富，王傲雪.里氏木霉產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)，2008，39（7）：29-33.

[15] 李艷紅.一株纖維素降解菌的篩選與鑒定[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（2）：34-35，39.

[16] 祝令香，徐建，于巍，等.一株纖維素降解菌的鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9（3）：255-257.

[17] 葉姜瑜.一種纖維素分解菌鑒別培養(yǎng)基[J].微生物學(xué)通報(bào)，1997，24（4）：251-252.

[18] 宮玉勝，李玉成，吳旺寶，等.中溫（37 ℃）纖維素分解菌的篩選及混合培養(yǎng)研究[J].生物技術(shù)，2010，20（2）：50-53.