兔波氏桿菌病的實驗室診斷

邵立巖

兔波氏桿菌病又稱為支氣管敗血波氏桿菌病，引起兔的一種以慢性鼻炎、支氣管肺炎及咽炎為特征的呼吸道傳染病。

1病原學(xué)診斷

1.1細(xì)菌培養(yǎng)

樣品采集：病兔，將滅菌棉拭子在無菌生理鹽水中浸濕，插入病兔鼻腔內(nèi)，深約10mm，小心轉(zhuǎn)動，蘸取鼻汁；死亡兔或撲殺致死兔，取鼻腔、氣管、肺部病變材料用于細(xì)菌分離培養(yǎng)。

細(xì)菌分離：將附著在棉拭上的黏液涂抹在麥康凱培養(yǎng)基或DHL培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h。肺部病變材料進行培養(yǎng)時，還可用血液瓊脂培養(yǎng)基。

結(jié)果判定：在改良麥康凱培養(yǎng)基上，支氣管敗血波氏桿菌菌落直徑約1～2mm，圓整、光滑、隆起、透明，略呈茶紅色，較大菌落中心厚，呈茶黃色。在DHL瓊脂平皿上形成無色半透明，2mm左右菌落。

1.2病原鑒定

生化試驗：不發(fā)酵碳水化合物，葡萄糖、荒糖、乳糖、甘露醇、果糖木糖呈堿性反應(yīng)。M.R.試驗、靛基質(zhì)試驗、硫化氫產(chǎn)生陰性，V-P試驗、枸櫞酸鹽利用、尿素酶產(chǎn)生、硝酸鹽還原、運動力試驗陽性。

動物接種試驗：常選用幼兔或豚鼠，鼻內(nèi)接種4h培養(yǎng)物0.1mL，應(yīng)在幾天內(nèi)出現(xiàn)鼻炎和肺膿腫的典型癥狀和病理變化。0.5mL劑量耳靜脈接種家兔，應(yīng)于24～48h內(nèi)死亡。從死亡兔的病變組織及撲殺的活兔的肺臟中均可分離到本菌。

血清平板凝集反應(yīng)：在清潔的玻片上加一滴陽性血清（約0.3mL），充分混入一鉑圈被檢菌，輕輕晃動玻片，室溫下放置2min。液滴中出現(xiàn)大凝集塊或小的粒狀凝集物，液體透明，判為陽性。每次試驗應(yīng)設(shè)有陰性血清對照和緩沖生理鹽水對照。結(jié)果判定：液滴中出現(xiàn)大凝集塊或小的顆粒狀凝集物，液體透明，判為陽性。

免疫熒光檢測抗原：應(yīng)用直接熒光抗體技術(shù)，檢查鼻甲骨、氣管、細(xì)支氣管及肺臟上皮細(xì)胞，觀察到顆粒樣抗原者判為陽性。該試驗一般在感染后7～28天即可檢出抗原。

2血清學(xué)診斷

2.1凝集反應(yīng)

將Ⅰ相菌接種到胰蛋白酶大豆肉湯中，37℃培養(yǎng)24～48h，加福爾馬林滅活，作為抗原。取凝集抗原與系列稀釋的被檢血清等量混合，37℃ 2h或56℃ 30min。4℃作用1夜判定。結(jié)果為1∶10被檢血清呈現(xiàn)明顯顆粒狀凝集者判為陽性。家兔在感染后2～4周，即可從血清中測出凝集抗體。

2.2免疫擴散試驗

抗原制備：將Ⅰ相菌接種在含綿羊鮮血的鮑-姜瓊脂培養(yǎng)基上，37℃潮濕溫箱中培養(yǎng)36h，向生長良好的Ⅰ相菌培養(yǎng)物中加入緩沖生理鹽水，充分振蕩后，使菌體分散于溶液中而制成懸液，其菌數(shù)為2500億/mL，再添加福爾馬林使其含量為0.37%（甲醛0.15%），搖勻，瓶口加蓋膠塞，放置37℃溫箱過夜（大約18～20h），次日取出，放室溫3～5天，每天振蕩3次。以500～1000轉(zhuǎn)/min離心沉淀20min，棄上清液；緩沖鹽水洗滌沉淀物，12000～15000轉(zhuǎn)/min離心20min，棄上清液；向沉淀加少量緩沖鹽水，按萬分之一比例加入硫柳汞防腐。采用輻射免疫擴散法（將其8倍沉淀抗體滴度的抗血清，按10%比例加入到1%瓊脂糖Tris緩沖溶液中，制成反應(yīng)板，然后打孔，室溫下濕室作用即可）測定，在反應(yīng)板上出現(xiàn)直徑10mm±1mm明顯沉淀者為合格抗原。分裝后4℃保存。

陽性血清制造：將上法接種于鮑-姜氏培主基上的Ⅰ相菌用滅菌PBS洗下，記數(shù)后加入福爾馬林滅活，耳靜脈注射3～6月齡的經(jīng)支氣管敗血波氏桿菌免疫擴散法檢查陰性的健康家兔，每只兔1mL。第一次菌數(shù)為100萬/mL，以后每周加強免疫1次，每次菌數(shù)遞增10倍，計6次。最后一次注射后4～5天采血，用免疫擴散法測定抗體滴度在8倍以上為合格，第七周自心臟采血，無菌收集血清。

免疫擴散試驗配制：0.7%～1.0%的瓊脂糖Tris反應(yīng)板，按試驗方法打孔，并在相應(yīng)孔中加入抗原或血清。室溫下濕室中作用，第二天開始判定，逐日觀察記錄結(jié)果，3天后最后判定?？乖着c被檢血清孔之間形成一條致密的沉淀線并且其末端與毗鄰的陽性血清孔與抗原之間的沉淀線相融合者判為陽性，陽性血清與抗原孔之間的沉淀線末端相毗鄰的被檢血清孔之抗原方向偏彎者亦判為陽性。觀察時可借助燈光或自然光源，特別是弱反應(yīng)須在強烈的日光燈光源照射下才能看清沉淀線。

采用本法檢查時，家兔被支氣管敗血波氏桿菌感染后7～10天即可檢出血清抗體，血清中沉淀抗體的存留期在1年以上。本法與細(xì)菌分離的符合率在95%左右。