龍葵毛狀根誘導(dǎo)及其抑菌活性的研究

王麗　劉琪　羅志文等

摘要 [目的] 探討龍葵毛狀根作為新的抑菌劑的可能性，為其開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。 [方法]以龍葵葉片為試驗(yàn)材料，利用發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，對(duì)龍葵葉片進(jìn)行毛狀根的誘導(dǎo)。并采用紙片法用龍葵毛狀根水提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)。[結(jié)果]龍葵葉片經(jīng)農(nóng)桿菌A4侵染后7 d產(chǎn)生毛狀根，毛狀根具有多分枝、生長(zhǎng)迅速且無(wú)向地性等特點(diǎn)，PCR及高壓紙電泳檢測(cè)結(jié)果表明Ri質(zhì)粒的tDNA已整合進(jìn)毛狀根中。相同質(zhì)量濃度下的龍葵毛狀根水提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用較強(qiáng)，龍葵毛狀根水提物的抑菌效果優(yōu)于龍葵實(shí)生根并具有顯著性差異。[結(jié)論]龍葵毛狀根對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和芽孢桿菌均有一定程度的抑制作用，其藥用價(jià)值有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞 龍葵；毛狀根誘導(dǎo)；水提物；抑菌作用

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）20-063-03

Abstract [Objective]The aim was to explore the possibility of using hairy roots of Solanum Nigrum L. as new antibacterial agent.[Method] Taking Solanum nigrum L.leaves as experimental material，using the transformation technology of the Agrobacterium rhizogenes， induction of hairy roots of Solanum Nigrum L. was studied.[Result]These findings suggested that hairy roots could be initiated from the cut edges of leaf explants 7 days after inoculation with the strain of A. Rhizogenes A4.The Hairy Roots had the Characters of Much branched， grow rapidly and negative geotropism and so on.The transformation of Ri tDNA was examined through PCR and high voltagepa-pereleetrophoresis. By filter paper method using hairy roots of Solanum nigrum L.and antibacterial activity was tested against Escherichia coli ，Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis，The results indicated that the inhibitory effect to E.coli and Staphylococcus aureus was better than that to Bacillus subtilis at the same mass concentration.The antibacterial effect of Solanum nigrum L. hairy root aqueous extract of Solanum nigrum L.antibacterial effect was better than the real root with the significant differences.[Conclusion] The study provided theoretical basis for the development and utilization of hairy roots of Solanum Nigrum L.

Key words Solanum nigrum L.； induction of hairy roots； Water extracts； Antimicrobial activity

龍葵（Solanum nigrum L. ）植株體內(nèi)含多種生物堿，如澳洲茄堿、澳洲茄邊堿、茄微堿及茄達(dá)堿等，全草入藥，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[1-3]，對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌等均有抑制作用[4]，因此作為植物殺菌劑其應(yīng)用領(lǐng)域十分廣闊。

用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)出的毛狀根通常具有生長(zhǎng)迅速、自主生長(zhǎng)、生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單、次生代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定、分化程度高及不易變異等特點(diǎn)，而且可把二次代謝物分泌至培養(yǎng)基中[5-7]。市場(chǎng)上的中藥材80%以上都來(lái)自藥用植物，其中又有相當(dāng)一部分來(lái)自于植物的根部，因此建立毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)于傳統(tǒng)藥材的生產(chǎn)方式具重要意義[8]，是大量生產(chǎn)植物有效成分的新途徑。

筆者以黑龍江省分布的普通龍葵植株葉片為試驗(yàn)材料，分別進(jìn)行了毛狀根的誘導(dǎo)及對(duì)毛狀根抑菌活性的研究，探討龍葵毛狀根作為新的抑菌劑的可能性，為龍葵毛狀根的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

龍葵葉片取自溫室培養(yǎng)的龍葵植株，龍葵毛狀根為其誘導(dǎo)所得，對(duì)照用龍葵實(shí)生根為7、8月份佳木斯大學(xué)校園內(nèi)采集所得。

發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4為佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院經(jīng)濟(jì)植物研究所低溫保存，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌株為佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室低溫保存。

農(nóng)桿菌菌種活化培養(yǎng)基：YEB培養(yǎng)基，pH 7.0；預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS，pH 5.8；共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+乙酰丁香酮（AS，200 mg/L）；除菌培養(yǎng)基：MS+400 mg/L頭孢噻肟鈉+100 mg/L羧芐青霉素，pH 5.8；毛狀根繼代培養(yǎng)基：MS，pH 5.8。

大腸桿菌及金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，pH 7.4。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1

外植體的獲得。龍葵種子采用常規(guī)消毒，于溫室內(nèi)播種于滅菌蛭石中，經(jīng)60 d培養(yǎng)獲得龍葵幼苗，取其幼葉作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2.2

菌種的活化。發(fā)根農(nóng)桿菌 A4在無(wú)菌條件下接種于YEB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，用于外植體侵染。

1.2.3

外植體的轉(zhuǎn)化方法。取龍葵幼葉作為外植體，經(jīng)常規(guī)消毒后切成邊長(zhǎng)為7～10 mm的小方塊，接種于MS培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2 d，之后將外植體浸入到活化好的菌液中，經(jīng)5 min后取出，用無(wú)菌濾紙吸干多余菌液放置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。經(jīng)共培養(yǎng)2 d后移至除菌培養(yǎng)基進(jìn)行除菌，每隔5 d轉(zhuǎn)接1次，經(jīng)反復(fù)除菌至培養(yǎng)基農(nóng)桿菌菌落消失后再轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.4

龍葵毛狀根PCR的檢測(cè)。

取龍葵無(wú)菌毛狀根200 mg，用CATB法[9]提取毛狀根總DNA，純化后作為PCR的擴(kuò)增模板，用CATB法提取未轉(zhuǎn)化龍葵根總DNA作陰性對(duì)照，用純化質(zhì)粒DNA的提取方法[10] 提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒作陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)Slighton等[11]發(fā)表的rolB引物：P1為5′GCTCTTGCAGTGGCTAGATTT3′，P2為5′GAAGGTGCAAGCTACCTCTC3′；rolC引物：P1為5′CTCCTGACATCAAACTCGTC3′，P2為5′TGCTTCGAGTTATGGGTACA3′。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體系為50 μl。向0.2 ml的硅化離心管中加入模板DNA 1 μl、H2O 34.6 μl、buffer 5 μl、MgCl2 3 μl和dNTP 1 μl，引物P1、P2分別放入2.5 μl、5單位的Taq酶0.4 μl。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃起始變性3 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性1 min，53.5 ℃退火1 min和72 ℃延伸反應(yīng)1 min，最后72 ℃延伸反應(yīng)10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳和EtBr染色進(jìn)行分析。

1.2.5

龍葵毛狀根的抑菌試驗(yàn)。

1.2.5.1

龍葵實(shí)生根及龍葵毛狀根提取液的制備。取龍葵實(shí)生根及龍葵毛狀根各10 g，切碎研磨，加50 ml水，浸泡1 h，90 ℃熱水提取3 h，過(guò)濾。藥渣再加水50 ml，90 ℃熱水提取3 h，過(guò)濾。合并2次濾液，加熱蒸發(fā)濃縮至10 ml，調(diào)節(jié)pH至7.4，在121 ℃、0.1 MPa條件下對(duì)提取液進(jìn)行高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后放入0～4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2

供試菌的活化。

將供試菌種接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，在 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后備用。

1.2.5.3

菌懸液的制備。將供試菌種放入盛有5 ml無(wú)菌水的試管中，無(wú)菌操作，振蕩搖勻。

1.2.5.4

龍葵實(shí)生根及龍葵毛狀根提取液的稀釋。采用倍比稀釋法[12]對(duì)龍葵實(shí)生根及毛狀根提取液進(jìn)行稀釋，稀釋后藥液質(zhì)量濃度分別為1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5 g/ml。

1.2.5.5

龍葵實(shí)生根及毛狀根的抑菌試驗(yàn)。采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法（簡(jiǎn)稱紙片法）[13] 進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，將已滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃，將其倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，水平放置冷卻至凝固。用玻璃涂棒蘸取菌懸液均勻涂抹于培養(yǎng)基上，然后取滅菌后的圓濾紙片（D=5 mm），分別浸沒(méi)提取液中1 h后取出，將濾紙片上的藥液濾干，放置30 s后無(wú)藥液滴下為宜，將紙片等距貼于瓊脂平板上，每皿3片，紙片間的距離均等適中，每一樣品重復(fù)3次，然后將含菌培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫箱中，經(jīng)倒置培養(yǎng)24 h后取出，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取其平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。體外抑菌定性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑在10 mm以下表示不敏感；抑菌圈直徑在10～15 mm范圍內(nèi)表示中度敏感；抑菌圈直徑在16～20 mm范圍內(nèi)表示高度敏感。以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低提取物濃度作為該水提物的最低抑菌濃度（MIC值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍葵毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)

發(fā)根農(nóng)桿菌A4侵染龍葵葉片后，葉片逐漸開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織化，葉片膨脹卷曲，體積可增大到未侵染前的1.5～2.0倍，7 d后從葉片的傷口處陸續(xù)產(chǎn)生乳白色的毛狀根（圖1），誘導(dǎo)出的毛狀根具有多分枝、生長(zhǎng)迅速且無(wú)向地性的特點(diǎn)；未被農(nóng)桿菌侵染的葉片無(wú)上述現(xiàn)象，葉片開(kāi)始變黃呈死亡狀。侵染過(guò)的葉片經(jīng)共培養(yǎng)2 d后移至MS+400 mg/L頭孢噻肟鈉+100 mg/L羧芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每隔5 d更換1次除菌培養(yǎng)基，約35 d葉片周?chē)辉佼a(chǎn)生菌圈（圖2），表明農(nóng)桿菌已被除去。除菌后的毛狀根可在無(wú)外源激素的MS培養(yǎng)基上迅速自主生長(zhǎng)，將無(wú)菌毛狀根放入MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。在初始5～7 d內(nèi)毛狀根生長(zhǎng)處于停滯期，7～30 d為生長(zhǎng)旺盛期，毛狀根經(jīng)培養(yǎng)不斷伸長(zhǎng)，可自主生長(zhǎng)。

2.2 龍葵毛狀根PCR的檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌A4誘導(dǎo)出的毛狀根進(jìn)行PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)化獲得的龍葵毛狀根中出現(xiàn)預(yù)期的基因條帶，未轉(zhuǎn)化的實(shí)生根則沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明農(nóng)桿菌A4所含的rol基因已經(jīng)整合到龍葵的基因組中并得到表達(dá)，誘導(dǎo)試驗(yàn)所得到的根是已轉(zhuǎn)化的毛狀根。

2.3 龍葵毛狀根抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1

龍葵毛狀根與實(shí)生根水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。由表1可以看出，金黃色葡萄球菌在濃度高于0.062 5 g/ml時(shí)，均出現(xiàn)了抑菌圈，7、8月份龍葵實(shí)生根和毛狀根的水提物處理最小抑菌圈直徑分別為（6.22±0.70）、（6.29±0.63）、（7.81±0.83） mm，最大抑菌圈直徑分別為（19.01±1.30）、（18.63±1.22）、（22.94±1.51） mm。

通過(guò)差異性分析得出，水提物濃度在高于0.500 0 g/ml時(shí)，在同一濃度水平下兩種實(shí)生根與毛狀根之間的抑菌差異顯著，而兩種實(shí)生根之間在同一濃度水平下抑菌差異不顯著。

試驗(yàn)結(jié)果表明，龍葵毛狀根水提取對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于龍葵7、8月份的實(shí)生根，龍葵7、8月份實(shí)生根的MIC值為0.500 0 g/ml，而龍葵毛狀根的MIC值為0.250 0 g/ml。

2.3.2

龍葵毛狀根與實(shí)生根水提物對(duì)大腸桿菌的抑制作用。由表2可以看出，毛狀根水提物濃度在0.125 0 g/ml以上開(kāi)始出現(xiàn)抑菌圈，其最小抑菌圈直徑為（7.50±0.68） mm，最大抑菌圈直徑為（21.12±1.83） mm，毛狀根水提物的MIC值為0.250 0 g/ml。7、8月份龍葵實(shí)生根水提物濃度在0. 250 0 g/ml以上時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)抑菌圈，最大抑菌圈直徑分別為（14.69±1.06）、（14.92±1.02） mm，均比毛狀根在同一濃度下的抑菌圈直徑要小。

通過(guò)差異性分析得出，在同一濃度水平下兩種龍葵實(shí)生根與毛狀根之間的抑菌差異顯著，而兩種實(shí)生根之間在同一濃度水平下抑菌差異不顯著。

試驗(yàn)結(jié)果表明，龍葵毛狀根水提取對(duì)大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于7、8月份龍葵實(shí)生根，7、8月份龍葵實(shí)生根水提物的MIC值為0.500 0 g/ml，而龍葵毛狀根水提物的MIC值為0.250 0 g/ml。

2.3.3

龍葵毛狀根與實(shí)生根水提物對(duì)芽孢桿菌的抑制作用。由表3可得出，龍葵毛狀根和7、8月份龍葵實(shí)生根3種水提物在濃度0.500 0 g/ml以上開(kāi)始出現(xiàn)抑菌圈，最小抑菌圈直徑分別為（8.56±0.98）、（7.32±0.86）、（6.54±0.66） mm，最大抑菌圈直徑分別為（12.74±0.98）、（12.26±1.14）、（11.59±0.66） mm。

經(jīng)顯著性差異分析得出，在同一濃度水平下兩種實(shí)生根水提物與毛狀根水提物之間的抑菌差異不顯著。

試驗(yàn)結(jié)果表明，龍葵毛狀根水提取和龍葵實(shí)生根水提物對(duì)芽孢桿菌的抑菌效果差異不大，3種根的水提物在濃度為1.000 0 g/ml時(shí)芽孢桿菌對(duì)其開(kāi)始敏感，3種水提物的MIC值均為1.000 0 g/ml。

2.3.4

龍葵毛狀根對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌抑制作用比較。

由圖4可以看出，金黃色葡萄球菌對(duì)濃度為0.250 0 g/ml的龍葵毛狀根水提物開(kāi)始表現(xiàn)敏感，抑菌圈直徑在所試范圍內(nèi)的最大值為（22.94±1.51） mm，毛狀根水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為0.250 0 g/ml。龍葵毛狀根對(duì)大腸桿菌的最大抑菌圈直徑為（21.12±1.83） mm，其對(duì)大腸桿菌的MIC值為0.250 0 g/ml。毛狀根水提物濃度為0.125 0和0.250 0 g/ml時(shí)，對(duì)芽孢桿菌測(cè)試均沒(méi)有出現(xiàn)抑菌圈，濃度為0.500 0 g/ml時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)抑菌圈，其對(duì)芽孢桿菌的MIC值為1.000 0 g/ml。

3 結(jié)論與討論

采用紙片法和溶液稀釋法對(duì)龍葵毛狀根不同濃度的水提物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，龍葵毛狀根的水提物在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和芽孢桿菌均有抑制作用，毛狀根的水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于其他兩種菌的抑菌效果，并且隨水提物質(zhì)量濃度的增大抑菌圈直徑呈上升趨勢(shì)。

對(duì)3種龍葵根的水提物進(jìn)行抑菌效果顯著性差異分析得出，在相同濃度水平下龍葵毛狀根與兩種龍葵實(shí)生根的水提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌效果差異顯著。抑菌結(jié)果可以看出，大腸桿菌與金黃色葡萄球菌在龍葵毛狀根的水提物質(zhì)量濃度為1.000 0、0.500 0 g/ml時(shí)均表現(xiàn)為高度敏感，對(duì)質(zhì)量濃度為0.250 0 g/ml的水提物表現(xiàn)出中度敏感；

毛狀根水提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC值均為0.250 0 g/ml，毛狀根水提物對(duì)芽孢桿菌的MIC值為1.000 0 g/ml。

龍葵毛狀根對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及芽孢桿菌均有一定程度的抑制作用，而對(duì)其他菌類(lèi)抑制作用有待于進(jìn)一步研究。龍葵毛狀根藥用價(jià)值研究將為開(kāi)發(fā)龍葵功能性食品及相關(guān)藥物奠定試驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。毛狀根中的組分及其各成分含量對(duì)于了解毛狀根的作用機(jī)理，更好地發(fā)揮毛狀根在藥用價(jià)值方面的作用意義較大，這些都有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 郝鑫.龍葵抑菌活性研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2014，10（4）：4.

[2] 李詠梅，王冰梅.龍葵濃縮汁對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，6（3）：231-232.

[3] 徐東花，于香月.龍葵的化學(xué)成分及藥理作用研究[J].黑龍江中藥，2007，6（2）：46-47.

[4] 李秀霞，張海洋.龍葵的藥理作用及臨床研究[J].佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998（21）：1.

[5] 杜曼.發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒及其在植物基因工程中的應(yīng)用[J].藥物生物技術(shù)，2005，12（3）：193.

[6] 孔靜，金鑫.毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用雜志，2003（3）：21-25.

[7] 岳才軍，劉永春.通過(guò)培養(yǎng)毛狀根生產(chǎn)藥物的研究進(jìn)展[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，15（l）：20-24.

[8] 丙和愷.藥用植物毛狀根的研究和應(yīng)用[J].自然雜志，1996，19（1）：23-26.

[9] ROGERS S O，BENDICH A J.Extraction of DNA from milligram amounts of fresh，herbarium and mummified plant tissues[J].Plant Mol Biol，1985，5（2）：69-70.

[10] 單斌，陳端，駢淮燕，等.細(xì)菌質(zhì)粒提取方法的研究[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001（1）：42-44.

[11] SLIGHTON J L，DURAND T M，JOUANIN L，et al.Nucleotide sequence analysis of TDNA of Agrobacterium rhizogenes agropine type plasmid：Isentification of open reading frames[J].Biol Chem，1986，261（1）：108-112.

[12] 曾克強(qiáng).幾種植物提取物和天然產(chǎn)物對(duì)馬鈴薯疫病的抑制作用[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（2）：90-96.

[13] 陳永芳，蘆韋華，王芳，等.新疆紫草毛狀根的誘導(dǎo)劑培養(yǎng)[J].西北植物學(xué)報(bào)，2008，28（12）：2423-2428.