觀賞靈芝菌種組織分離技術(shù)研究

鄭勇 郭軍 陳一龍 韋靜宜

摘 要 試驗(yàn)采用子實(shí)體組織分離法獲得觀賞靈芝菌種，驗(yàn)證了馬鈴薯綜合培養(yǎng)基適合作觀賞靈芝菌絲生長的母種培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件是避光培養(yǎng)、溫度25～28℃，鏡檢和出菇試驗(yàn)表明，菌絲長勢良好，整齊濃密，生長速度較快，最快達(dá)15 mm/d，經(jīng)過8～9 d培養(yǎng)后的菌絲活力最強(qiáng)，宜做母種使用。

關(guān)鍵詞 觀賞靈芝；菌種；子實(shí)體；組織分離；馬鈴薯綜合培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：S567.3+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2015）28-052-03

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20151110.1011.036.html 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015/11/10 10：11：00

靈芝（Ganoderma lucidum）隸屬于非褶菌目靈芝科靈芝屬，種類較多，已報(bào)道的有200余種[1]。在靈芝的栽培過程中，通過控制溫度、光線、空氣等環(huán)境條件，可以培養(yǎng)出形態(tài)各異、顏色多變的子實(shí)體，也可以制作靈芝盆景，具有較強(qiáng)的觀賞性[2]。菌種是觀賞靈芝生產(chǎn)的首要條件，如何獲得優(yōu)良的菌種直接影響到生產(chǎn)的成敗。試驗(yàn)采用子實(shí)體組織分離法獲得觀賞靈芝菌種，通過鏡檢和出菇試驗(yàn)驗(yàn)證菌種質(zhì)量，提出適宜觀賞靈芝的母種培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，為分離菌種和種質(zhì)資源的搜集提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采自位于重慶市沙坪壩區(qū)鳳凰鎮(zhèn)的重慶市金瓊農(nóng)業(yè)股份合作社，觀賞靈芝采用塑料小袋栽培，采集頭潮菇、外觀典型、菌蓋表面顏色由白色漸變?yōu)闇\黃色的單朵菇作種菇。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離

采用子實(shí)體組織分離法。

1.2.1.1培養(yǎng)基配制

馬鈴薯綜合培養(yǎng)基作為母種培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂條18 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、VB1 10 mg、水1000 mL，具體制作方法如下。

將馬鈴薯洗凈、去皮、挖掉芽眼，切成大小均勻的小塊，稱取200 g，用小鍋加入約1700 mL水，燒開后放入馬鈴薯小塊，文火煮20 min。瓊脂條剪成小段，放入馬鈴薯汁中文火煮熔，煮熔時(shí)間5 min左右，期間適當(dāng)攪拌，防止糊鍋。用4層預(yù)濕的紗布過濾取汁，用燒杯量取濾液1000 mL，加入配方中其他營養(yǎng)物質(zhì)，充分?jǐn)嚢杈鶆?，趁熱用三角瓶和試管分裝，分別用封口袋和棉塞、牛皮紙封口，然后置高壓滅菌器中控溫121℃下滅菌，滅菌時(shí)間25 min，趁熱取出試管在工作臺(tái)上傾斜排放，擺成斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2種菇消毒

按無菌操作要求，將種菇放入75%酒精溶液中，浸泡40 s左右，不斷翻動(dòng)以充分殺死種菇表面的雜菌。用火焰燒除種菇表面附著的酒精，待火焰自然熄滅。

1.2.1.3組織挑取

將種菇放在培養(yǎng)皿中的滅菌脫脂棉上，用消過毒的解剖刀在芝蓋與芝柄中部縱切一刀，撕開后在芝蓋與芝柄交接處的菌肉上用解剖刀橫豎劃些口子，挑取0.2～0.5 cm見方的小塊組織進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.1.4菌絲培養(yǎng)與純化

將小塊組織接在平板培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中在恒溫26℃、避光下培養(yǎng)菌絲，經(jīng)過2 d的培養(yǎng)，可以看到組織塊上萌發(fā)白色、絨毛狀的氣生菌絲，挑取生長快、整齊、濃而健壯的菌落前端的菌絲，轉(zhuǎn)接至新的馬鈴薯綜合培養(yǎng)基平板上純化2次，最后挑取菌絲接種至斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌絲長滿試管斜面，獲得觀賞靈芝母種。

1.2.2 菌絲顯微觀察

用三角瓶按蒸餾水150 mL+瓊脂粉2.7 g，搖勻封口，在恒溫121℃下滅菌20 min，制作蒸餾水培養(yǎng)基。將分離到的母種接至平板蒸餾水培養(yǎng)基上，置培養(yǎng)箱中在恒溫26℃、避光下培養(yǎng)菌絲，培養(yǎng)4 d，在接種點(diǎn)周圍可以看到稀疏的菌絲體，用接種針挑取菌落邊緣的基內(nèi)菌絲，制作水鏡片，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)。

1.2.3 菌絲生長長度測量

將母種菌絲轉(zhuǎn)接至平板培養(yǎng)基上，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)菌絲，培養(yǎng)條件是避光、溫度26℃，每日測量菌落的直徑，計(jì)算菌絲每日生長長度。

1.2.4 出菇試驗(yàn)

將分離獲得的母種擴(kuò)大繁殖，移接培養(yǎng)成原種，做出菇試驗(yàn)。采用20 cm×45 cm折角袋，培養(yǎng)料配方為棉籽殼40%、木屑40%、玉米粉6%、麩皮6%、米糠6%、蔗糖1%、石膏粉1%，培養(yǎng)料含水量60%，出菇試驗(yàn)菌袋數(shù)量30袋，在適宜的條件下發(fā)菌，觀察子實(shí)體的特征與主要性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)觀察

菌種質(zhì)量鑒定一般從菌種的純度、長勢、顏色、菌齡、均勻度、顯微鏡下菌絲形態(tài)觀察、出菇試驗(yàn)等方面進(jìn)行鑒定。按“1.2.1菌種分離”獲得觀賞靈芝菌種，在馬鈴薯綜合培養(yǎng)基上，菌絲長勢旺盛，氣生菌絲潔白纖細(xì)、致密均勻，菌落生長整齊。

2.2 菌絲形態(tài)觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)（圖1）可以看到，分離到的菌絲透明、纖細(xì)、粗細(xì)較均勻，菌絲向不同的方向發(fā)出分枝，在單條菌絲上有多處喙?fàn)钔黄穑哂忻黠@的鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，說明為雙核有生殖能力的菌種。

2.3 菌絲生長速度觀察

從圖2菌絲每日生長長度可以看出，第1天、第2天菌絲生長非常緩慢，生長速度分別為1 mm/d和2 mm/d，第3天起菌絲的生長速度逐漸加快，到第8 d和第9天，菌絲生長速度最快達(dá)15 mm/d，此時(shí)菌絲生長旺盛，活力最強(qiáng)。之后菌絲的生長速度明顯減緩，第10天、第11天生長速度分別為12 mm/d、9 mm/d，肉眼觀察菌絲更加濃密，菌苔變得更厚。

2.4 出菇試驗(yàn)

從接種至菌絲長滿培養(yǎng)袋需要22～24 d，菌種成活率達(dá)到100%，菌絲濃白健壯，生長整齊。從圖3可以看到子實(shí)體具有靈芝特有的觀賞形態(tài)與色澤，菌蓋半圓形或近圓形，橫徑2～16 cm，菌蓋厚1～2 cm，蓋面顏色出菇初期為乳白色，后漸變呈乳黃、淡黃，成熟子實(shí)體為黃色褐，有明顯的同心環(huán)帶和環(huán)溝，表面有油漆狀光澤。菌柄側(cè)生，近圓柱形，粗2～4 cm，長5～14 cm，表面有與菌蓋一樣的油漆狀光澤。出菇試驗(yàn)是最實(shí)際的菌種質(zhì)量鑒定方法，試驗(yàn)表明分離到的菌種種性純、活力強(qiáng)，可以作為栽培菌種使用。

3 討論

子實(shí)體組織分離法是生產(chǎn)中常用的菌種分離方法，能否獲得優(yōu)良的原生母種與培養(yǎng)基的營養(yǎng)、水分、酸堿度等有關(guān)，也與培養(yǎng)時(shí)間、溫度、光線等是否適宜有著十分密切的關(guān)系[1]。觀賞靈芝是木腐性菌類，適宜菌絲生長的栽培基質(zhì)pH值4.5～5.2，主要營養(yǎng)物質(zhì)是碳水化合物和含氮化合物，同時(shí)也需要少量的無機(jī)鹽、維生素等。從試驗(yàn)結(jié)果來看，馬鈴薯綜合培養(yǎng)基C/N比、pH值等能夠滿足觀賞靈芝組織塊萌發(fā)菌絲及菌絲生長需要的培養(yǎng)條件。母種培養(yǎng)基有很多種配方，試驗(yàn)中還采用PDA培養(yǎng)基、木屑煮汁培養(yǎng)基、子實(shí)體煮汁培養(yǎng)基作母種培養(yǎng)基分離到觀賞靈芝菌種，通過長勢觀察，馬鈴薯綜合培養(yǎng)基更適合作觀賞靈芝組織分離的母種培養(yǎng)基。

從培養(yǎng)的環(huán)境條件來看，種菇組織塊在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為避光、溫度可控制在25～28℃，培養(yǎng)時(shí)間約2 d，組織小塊上萌發(fā)出稀疏的菌絲；挑取生長快、整齊、濃而健壯的菌落前端的菌絲，轉(zhuǎn)接至新的馬鈴薯綜合培養(yǎng)基平板上純化2次，最后挑取菌絲接種至斜面培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。接種后第3天菌絲開始快速生長，長勢良好，整齊濃密；經(jīng)過8～9 d培養(yǎng)，生長速度最快達(dá)15 mm/d，此時(shí)菌絲生長旺盛、活力最強(qiáng)，宜作栽培用種。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張江萍.現(xiàn)代食用菌學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2013.

[2] 潘崇環(huán)，馬立驗(yàn)，韓建明，等.食用菌栽培新技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

（責(zé)任編輯：敬廷桃）