豬痢疾短螺旋體的檢測(cè)、感染情況調(diào)查及免疫原性初步分析

鳳鳴 朱明星 肖新 宇蔡斌

摘要：通過(guò)對(duì)豬痢疾短螺旋體的檢測(cè)以及感染情況調(diào)查，從而進(jìn)行免疫原性分析。對(duì)興化市及其周邊地區(qū)50個(gè)豬養(yǎng)殖場(chǎng)中發(fā)生豬痢疾的感染情況進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)豬痢疾的端螺旋體實(shí)施檢測(cè)，進(jìn)而培養(yǎng)并進(jìn)行免疫原性分析。在調(diào)查的50個(gè)豬養(yǎng)殖場(chǎng)中發(fā)生感染的病豬占到了6.3%，通過(guò)免疫原性初步分析，可以通過(guò)免疫重組引起抗體的有效性提高。豬痢疾短螺旋體的檢測(cè)、感染情況調(diào)查及免疫原性初步分析可以為豬痢疾的疫苗制作提供一個(gè)理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬痢疾；短螺旋體的檢測(cè)；感染情況調(diào)查；免疫原性初步分析

豬痢疾在臨床上又叫做血痢[1]，是一種感染生長(zhǎng)育肥期豬的腸道傳染病，而豬痢疾短螺旋體是一種細(xì)菌性病原，該病原體會(huì)引起豬的大量死亡，從而給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，豬在感染短螺旋體病原體后在臨床上主要表現(xiàn)為消瘦、脫水、糞便變紅。近年來(lái)隨著抗生素藥物的使用，豬痢疾短螺旋體病原體逐漸的已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性，一些常規(guī)的抗生素已經(jīng)逐漸的失去了作用，因此，加強(qiáng)豬痢疾短螺旋體的檢測(cè)以及免疫原性分析顯得至關(guān)重要?，F(xiàn)主要對(duì)豬痢疾短螺旋體的檢測(cè)、感染情況調(diào)查及免疫原性初步分析等相關(guān)資料予以回顧分析，就其中的主要內(nèi)容報(bào)道如下。

1材料及方法

1.1材料

對(duì)興化市及其周邊地區(qū)50個(gè)豬養(yǎng)殖場(chǎng)中發(fā)生豬痢疾的感染情況進(jìn)行調(diào)查，并從興化市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心收集了腹瀉樣品38份、腸道樣本60份，此外還從興化市的養(yǎng)殖場(chǎng)采取了腸道樣品280份。主要來(lái)源是母豬以及不同齡期的育肥豬的糞便，且這些樣本采集對(duì)象均不同程度的表現(xiàn)出腹瀉，此外還需要準(zhǔn)備相關(guān)的試劑，主要有血液及DNA提取試劑盒以及糞便DNA提取試劑盒，另外還有厭氧袋、壯觀霉素、革蘭氏染色液等。需要用到的儀器包括高速冷凍離心機(jī)、生物安全柜、掃描電子顯微鏡、恒溫水浴鍋以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器。在免疫原性分析中需要用到的有PCR酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶。

1.2方法

豬痢疾短螺旋體感染情況調(diào)查主要采用實(shí)地調(diào)查的方法，對(duì)不同養(yǎng)殖場(chǎng)豬痢疾情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

對(duì)于豬痢疾短螺旋體的檢測(cè)主要有以下幾個(gè)步驟[2]：①糞便DNA的提取，取180mg左右的豬痢疾糞便，放置到2mL的離心管中，此后將該離心管放到冰上面，加入1.4mL的ASLbutter到每一個(gè)管中，搖勻之后放置在70℃條件下，時(shí)間為5min，此后進(jìn)行振蕩并離心，去除1個(gè)新的離心管吸取離心之后的懸浮液1.2mL，并向其中加入抑制劑，再次振蕩，直到抑制片完全吸收，之后再次離心操作，離心結(jié)束后取出1.5mL的離心管放入上層懸浮液，再次離心，在離心過(guò)程中加入一些外加劑，直到提取出糞便內(nèi)的病原體DNA；②腸黏膜組織的DNA提取，首先刮取25mg的腸黏膜放入1.5mL的離心管中，同時(shí)加入180μLATL的緩沖液，然后加入20μL蛋白酶K，在混合之后，保持56℃條件下對(duì)其孵育，在孵育過(guò)程中定期的搖動(dòng)離心管，此后取出離心管渦旋15秒，加入200μL緩沖液搖勻，再加入200μL的無(wú)水乙醇，渦旋充分混合。提取裂解液加入到2mL的吸附柱中，離心之后放入一個(gè)新的收集管，此后再經(jīng)過(guò)洗脫液最終，提取出腸黏膜組織的DNA；③陽(yáng)性樣本的分離培養(yǎng)[3]，在上面的檢測(cè)中將檢測(cè)出來(lái)的陽(yáng)性樣本需要及時(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)，接種之后，在培養(yǎng)基上分別加入壯觀霉素、多黏菌素以及萬(wàn)古霉素，根據(jù)該病原體的生活條件，需要在厭氧條件下保持在37℃，培養(yǎng)時(shí)間為5天左右，在培養(yǎng)完成后，使用顯微鏡對(duì)豬痢疾端螺旋體實(shí)施檢測(cè)，并進(jìn)行革蘭氏染色，染色的步驟分別為龍膽紫、碘液、脫色液、沙黃，每一個(gè)步驟持續(xù)時(shí)間為10秒，掃描電子顯微鏡。

2結(jié)果

2.1熒光定量PCR檢測(cè)分析

對(duì)378份樣本DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，在檢測(cè)結(jié)果中通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)有35份陽(yáng)性樣本，在檢出的陽(yáng)性樣本中，在臨床表現(xiàn)腹瀉的病豬感染率較大，而從動(dòng)物防疫疾病預(yù)防和控制中心搜集的無(wú)腹瀉樣本中感染率比較低，此外在不同地區(qū)的病豬感染方面，沒有表現(xiàn)出明顯的差異。

2.2基因BlpA生物信息分析

根據(jù)BlpA的基因序列，使用DNAStar軟件找出其中的ORF，經(jīng)過(guò)分析，大小是816bp，由271個(gè)氨基酸組成，理論上分子量為29652.55Da，等電位是4.47，屬于外源蛋白。將豬痢疾短螺旋體的DNA作為模版，在PCR電泳過(guò)程中出現(xiàn)了一目亮帶，主要在816bp附近，這個(gè)和我們預(yù)期的設(shè)想是一致的。

3討論

豬痢疾是一種傳染性比較強(qiáng)的疾病，在育肥期的豬中比較常見[4]，同時(shí)發(fā)病率比較高，在對(duì)興化市的50個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)開展調(diào)查之后，感染的病豬占到了6.3%，并且出現(xiàn)了部分病豬死亡的事件，所以豬痢疾屬于養(yǎng)豬過(guò)程中一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)難題，并且會(huì)引起一系列的不良反應(yīng)，首先豬的正常生長(zhǎng)受到了限制，生長(zhǎng)比較慢，提高了飼養(yǎng)過(guò)程中的成本，養(yǎng)豬場(chǎng)需要花費(fèi)更多的人力和物力去管理病豬，同時(shí)豬痢疾具有傳染性，會(huì)嚴(yán)重影響到其他健康豬的生長(zhǎng)，可能會(huì)引起較多豬的感染，嚴(yán)重的引發(fā)病豬死亡，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，豬痢疾需要及時(shí)的診斷和治療，才能盡可能的降低由此造成的經(jīng)濟(jì)損失。

在豬痢疾端螺旋體檢測(cè)過(guò)程中對(duì)378份樣本DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，在檢測(cè)結(jié)果中通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)有35份陽(yáng)性樣本，而且280份樣品是從腹瀉的病豬采集的，其余的98是來(lái)自興化市的動(dòng)物疾病預(yù)防和控制中心，這些是沒有腹瀉的，在沒有腹瀉的檢測(cè)中陽(yáng)性樣本3份，其余的32份均是來(lái)自腹瀉的病豬，而且不同地區(qū)的豬痢疾發(fā)病率是有差異的，但是差異不明顯。不同齡期的豬在豬痢疾發(fā)病方面也是有差異的，將前幾年豬痢疾發(fā)病率的調(diào)查的豬痢疾病情發(fā)展比較，發(fā)現(xiàn)豬痢疾病情發(fā)展出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，這和學(xué)者的研究工作是分不開的。

豬痢疾屬于一種常見病，可以預(yù)防治療，具體的就是要做好每個(gè)環(huán)節(jié)的監(jiān)測(cè)工作，并注意養(yǎng)豬場(chǎng)的環(huán)境問(wèn)題，特別是在夏季時(shí)，一定要定期的進(jìn)行殺菌消毒。

通過(guò)對(duì)豬痢疾短螺旋體免疫原性初步分析[5]，發(fā)現(xiàn)豬痢疾短螺旋體在長(zhǎng)期的治療過(guò)程中主要是依靠一些抗生素藥物進(jìn)行治療，缺乏疫苗、各種抗生素的使用導(dǎo)致豬痢疾短螺旋體發(fā)生變異，逐漸的產(chǎn)生了抗藥性。在后期的治療過(guò)程中普通的一些抗生素藥物已經(jīng)失去了作用，及時(shí)有效地研制出豬痢疾短螺旋體的疫苗顯得至關(guān)重要。

當(dāng)前階段，對(duì)于豬痢疾短螺旋體的疫苗研究主要還在毒力蛋白上，使用克隆的方法可以實(shí)現(xiàn)亞單位疫苗的制作，而且在制作過(guò)程中，需要的時(shí)間短，可以大規(guī)模的生產(chǎn)，并且制作成本低，值得臨床上研究和制作。

豬痢疾短螺旋體的編碼基因Blpa進(jìn)行了擴(kuò)增，并重新構(gòu)建了重組質(zhì)粒，構(gòu)建成功后表達(dá)出了重組蛋白，并提取了相關(guān)樣品，提取出來(lái)的樣品對(duì)小鼠實(shí)施免疫，在免疫過(guò)程中監(jiān)測(cè)血清中特異性抗體的含量變化，在第一次免疫結(jié)束后，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，小鼠體內(nèi)的血清特異性抗體有一個(gè)較高的水平，而且在一段時(shí)間內(nèi)沒有發(fā)生改變，通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了使用重組蛋白可以誘發(fā)高水平抗體的產(chǎn)生，有利于提高豬的免疫力，也為豬痢疾短螺旋體疫苗的研制工作提供了一個(gè)科學(xué)依據(jù)。

大規(guī)模的養(yǎng)豬場(chǎng)得到了快速發(fā)展，但是豬痢疾短螺旋體會(huì)嚴(yán)重影響到豬的正常生長(zhǎng)以及養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)利益，所以做好豬痢疾短螺旋體感染的調(diào)查工作很重要，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行免疫原性初步分析，進(jìn)一步的掌握短螺旋體的免疫反應(yīng)，從而確定最佳的藥品做好預(yù)防和治療工作。此外，豬的其他一些疾病有可能會(huì)被誤診為豬痢疾短螺旋體，需要明確豬痢疾短螺旋體的診斷標(biāo)準(zhǔn)，比如在檢測(cè)過(guò)程中使用的熒光PCR檢測(cè)技術(shù)，就具有重要的診斷價(jià)值。

總之，豬痢疾短螺旋體的檢測(cè)具有重要意義，做好豬痢疾短螺旋體的預(yù)防和治療工作需要選擇合適的抗生素藥物，同時(shí)還需要積極地研制疫苗，從而做好疫苗接種，避免豬痢疾短螺旋體感染的發(fā)生。

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