河北省部分地區(qū)柔嫩艾美耳球蟲野外分離株耐藥性檢測

蔣祿峰 常麗云 張晶 張夢茜 秦建華 趙月蘭 包永占

摘要：將柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）石家莊、滄州、保定、唐山分離株感染14日齡羅曼蛋公雛，每個地區(qū)設(shè)立5個用藥組、1個感染不用藥對照組和1個不感染不用藥對照組，以POAA、RLS、ROP、ACI作為評定指標(biāo)對該蟲株對氯羥吡啶、莫能菌素、地克珠利、妥曲珠利、磺胺喹噁啉5種常用抗球蟲藥的抗藥性進(jìn)行了綜合評定，分析了該地區(qū)球蟲的抗藥性及用藥對策。

結(jié)果表明：E.tenella石家莊分離株對氯羥吡啶呈完全抗藥性，對莫能菌素、妥曲珠利、磺胺喹嗯啉呈重度抗藥，對地克珠利表現(xiàn)輕度抗藥；E.tenella滄州分離株對氯羥吡啶、莫能菌素、地克珠利呈完全抗藥性，對妥曲珠利、磺胺喹噁林呈中度抗藥；E.tenella保定分離株對氯羥吡啶呈完全抗藥性，對妥曲珠利呈重度抗藥，對莫能菌素、地克珠利、磺胺喹嗯啉呈中度抗藥；E.tenella唐山分離株對莫能菌素、妥曲珠利呈完全抗藥性，對氯羥吡啶、地克珠利呈中度抗藥，對磺胺喹噁林呈輕度抗藥。

關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲；抗球蟲藥；耐藥性；雞

雞球蟲病是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病之一，尤以柔嫩艾美耳球蟲致病性最強，柔嫩艾美耳球蟲寄生于雞腸道上皮細(xì)胞內(nèi)，引起腹瀉、血便、生長遲緩、飼料轉(zhuǎn)化率降低，常導(dǎo)致雛雞大批死亡，即使發(fā)病耐過的雞生長發(fā)育也比較遲緩。目前防治該病最主要的方法是應(yīng)用化學(xué)性抗球蟲藥物，隨著抗球蟲藥的長期使用而產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致抗球蟲藥物使用年限縮短，防治效果不佳甚至失敗，引起臨床或亞臨床雞球蟲病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來新的抗球蟲藥物不斷上市，但在使用中發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)治療效果不盡相同。為更好的利用藥物，及時了解和評價抗球蟲藥對當(dāng)?shù)厍蛳x的治療效果，降低球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失，更好地指導(dǎo)生產(chǎn)，對雞球蟲病及球蟲抗藥性的調(diào)查、診斷、研究和分析是養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的必要前提。本試驗對河北省石家莊、滄州、保定、唐山地區(qū)分離的球蟲株采用5種常見的抗球蟲藥進(jìn)行了藥敏對比檢測，旨在為這些地區(qū)雞球蟲病的防控策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用的蟲株

采自石家莊、滄州、保定、唐山的雞盲腸內(nèi)容物，按常規(guī)方法分離m球蟲卵囊，加入2.5%重鉻酸鉀溶液，置于27～30℃恒溫培養(yǎng)箱中，前18h每3h攪拌1次，以后每日攪拌4～5次，待85%以上卵囊孢子化后，收集保存于4℃冰箱備用。

1.2 試驗動物

450只購自河北保定徐水大午禽業(yè)有限公司的1日齡羅曼蛋公雛，飼養(yǎng)環(huán)境在雛雞購買前一周進(jìn)行熏蒸消毒，確保在兀菌、無球蟲狀態(tài)下隔離飼養(yǎng)，飼料不添加任何抗球蟲藥物，飼料、飲水、食槽等用具均高溫消毒。

1.3 單卵囊的分離與鑒定

1.3.1 瓊脂塊的制作

稱取lg瓊脂糖，置于三角燒瓶中，加入100mL蒸餾水，攪勻、煮沸，用吸管吸取瓊脂液澆注于載玻片上，厚度2～3mm，靜置凝固后，用刀片將瓊脂糖切成約4mmx4mm的小塊，再將小塊分散排列到另一塊載玻片上，待用。

1.3.2 單卵囊的分離

用牙簽沾取初次分離備用的卵囊懸液于瓊脂滴上，低倍鏡下仔細(xì)觀察為單個卵囊時調(diào)至高倍鏡下觀察，選擇卵囊孢子化完全、形態(tài)、大小符合柔嫩艾美耳球蟲形態(tài)學(xué)特征的做好標(biāo)記，飼喂14日齡雛雞。接種后的雛雞單個隔離飼養(yǎng)于嚴(yán)格消毒的雞籠中，感染后第5天起收集糞便鏡檢，鏡下觀察球蟲的形態(tài)、大小一致并與祖代相吻合的，標(biāo)記好收集培養(yǎng)。感染后第8天，全部撲殺，剖檢所有雞只，取盲腸內(nèi)容物分離卵囊，培養(yǎng)至孢子化，置于4℃冰箱中備用。

1.4 試驗藥物用法與用量

共計5種，分別是：氯羥吡啶（粉劑，蘇州某獸藥股份有限公司，使用方法為每1kg飼料添加0.5g成品）；莫能菌素（粉劑，使用方法為每1kg飼料添加0.5g成品）；地克珠利（溶液，江蘇某動物藥業(yè)公司，使用方法為每1000mL水中添加0.2mL）；妥曲珠利（溶液，山東某獸藥有限公司，使用方法為每1000mL水中添加0.5mL）；磺胺喹嗯啉（可溶性粉，上海某動物保健品有限公司，使用方法為每1000mL水中添加0.5g）。

1.5 試驗設(shè)計

將試驗用雞于14日齡早晨逐只空腹稱重，淘汰弱雛及體重過大過小者，并進(jìn)行編號。然后根據(jù)體重離散度隨機分組，四個地區(qū)蟲株各分七組，5個給藥組，1個陽性對照（感染不給藥）組和1個陰性對照（不感染不給藥）組，每組10只，總體重基本一致。分組完畢后，除陰性對照組外，其他各組雞在14日齡用鈍頭注射器經(jīng)口接種5×l0⁴個柔嫩艾美耳球蟲石家莊、滄州、保定、唐山分離株孢子化卵囊，對5個給藥組進(jìn)行給藥，直至試驗結(jié)束。藥物劑量和給藥方式見1.4部分。攻蟲后每天觀察雞的生長情況和發(fā)病情況，對血便出現(xiàn)情況和死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計，試驗過程中對死亡雞立即進(jìn)行稱重和剖檢，確認(rèn)是否死于球蟲病，第8天時將所有雞稱重并撲殺，收集盲腸待檢。

1.6 抗藥性評定指標(biāo)

選用最適抗球蟲活性百分率（POAA）、病變記分減少率（RLS）、相對卵囊產(chǎn)量（ROP）和抗球蟲指數(shù)（ACI）4項指標(biāo)對抗藥性進(jìn)行綜合判定。

POAA=[（感染用藥組GSR-陽性組CJSR）÷（陰性組GSR-陽性組CJSR）]×100%，其中，GSR=末重÷始重。POAA> 50%，判為陰性；POAA≤50%，判為陽性。RLS=[（陽性組病變記分一感染用藥組病變記分）÷陽性組病變記分]×100%。RLS≥50%，判為陰性；RLS<50%，判為陽性。ROP=（感染用藥組卵囊數(shù)÷陽性組卵囊數(shù)）×100%。ROP<15%，判為陰性；ROP≥15%，判為陽性。ACI=（存活率+相對增重率）一（病變值+卵囊值）。ACI≥160，判為陰性；ACI<160，判為陽性。其中：存活率（%）=存活只數(shù)÷開始雞數(shù)×100%；相對增重率（%）=陽性組或感染用藥組增重率÷陰性組增重率×100%；病變值=每組平均病變記分×10；卵囊值：當(dāng)陰性組或感染用藥組OPCJ值與陽性組OPCJ值的比值分別為小于1%、1%～25%、26%～50%、51%～75%和76%～100%時，卵囊值分別為0，5，10，20和40。

1.7 抗藥性判斷標(biāo)準(zhǔn)

按黃兵等方法，以上4項指標(biāo)中出現(xiàn)陽性指標(biāo)的數(shù)量來確定藥物的抗藥程度，敏感（Sensitive，S）：ACI、RLS、ROP、POAA中4項指標(biāo)均為陰性；輕度抗藥（Light resistant，LR）：4項指標(biāo)中有1項指標(biāo)為陽性；中度抗藥（Middle resistant，MR）：4項指標(biāo)中有2項指標(biāo)為陽性；重度抗藥（serious resistant，SR）：4項指標(biāo)中有3項指標(biāo)為陽性；完全抗藥（Completeresistant，CR）：4項指標(biāo)全為陽性。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和病理變化

各攻蟲組試驗雞在攻蟲后第4d時，臨床上開始出現(xiàn)食欲不振、精神委頓、羽毛逆立、縮脖呆立、扎堆，排血便，甚至死亡，攻蟲7d后癥狀有所緩解，死亡停止。

2.2 耐藥性檢測結(jié)果

由表1一表4可以看出，柔嫩艾美耳球蟲對所選的5種抗球蟲藥物均產(chǎn)生不同程度的抗藥性，但根據(jù)POAA、RLS、ROP和ACI4項指標(biāo)綜合判斷，E.tenella石家莊分離株對氯羥吡啶呈完全抗藥性，莫能菌素、妥曲珠利、磺胺喹噁啉呈重度抗藥，對地克珠利表現(xiàn)輕度抗藥性（表1）；E.tenella滄州分離株對氯羥吡啶、莫能菌素、地克珠利呈完全抗藥性，對妥曲珠利、磺胺喹嗯啉呈中度抗藥（表2）；E.tenella保定分離株對氯羥吡啶呈完全抗藥性，對妥曲珠利呈重度抗藥，對莫能菌素、地克珠利、磺胺喹噁啉呈中度抗藥（表3）；E.Tenella唐山分離株對莫能菌素、妥曲珠利呈完全抗藥性，對氯羥吡啶、地克珠利呈中度抗藥，對磺胺喹噁啉呈輕度抗藥（表4）。

3 討論與小結(jié)

雞球蟲幾乎對所有抗球蟲藥物產(chǎn)生耐藥性，因此使用抗球蟲藥物應(yīng)有一個合理的用藥方案，以確保藥物的治療效果，延緩雞球蟲耐藥性的產(chǎn)生，從而有效地預(yù)防和控制雞球蟲病的發(fā)生。聯(lián)合用藥是在同一個飼養(yǎng)期內(nèi)同時用2種或2種以上抗球蟲藥，通過藥物間的協(xié)同作用，延緩耐藥蟲株的產(chǎn)生，增強藥效，同時可擴(kuò)大抗球蟲譜。輪換用藥，季節(jié)性地或定期變換用藥，每隔3個月或半年改換一種抗球蟲藥，目的是避免耐藥性蟲株的m現(xiàn)，但不改變作用機理和作用峰期相同的藥物，以免產(chǎn)生交叉耐藥性或變換用藥后效果不明顯。

本試驗檢測4個不同地區(qū)4株柔嫩艾美耳球蟲對5種抗球蟲藥的療效對比情況，結(jié)果表明：E.tenella石家莊分離株對氯羥吡啶呈完全抗藥性，對莫能菌素、妥曲珠利、磺胺喹噁啉呈重度抗藥，對地克珠利表現(xiàn)輕度抗藥性；E.tenella滄州分離株對氯羥吡啶、莫能菌素、地克珠利呈完全抗藥性，對妥曲珠利、磺胺喹噁啉呈中度抗藥；E.tenella保定分離株對氯羥吡啶呈完全抗藥性，對妥曲珠利呈重度抗藥，對莫能菌素、地克珠利、磺胺喹噁啉呈中度抗藥；E.tenella唐山分離株對莫能菌素、妥曲珠利呈完全抗藥性，對氯羥吡啶、地克珠利呈中度抗藥，對磺胺喹噁呈輕度抗藥。

氯羥吡啶是吡啶類抗球蟲藥，該藥使用初期對球蟲有較好的效果，但球蟲對其極易產(chǎn)生抗藥性，通常連續(xù)使用2～3年，其ACI就明顯下降。本試驗中4株E.tenella均已對氯羥吡啶產(chǎn)生不同程度的抗藥性，尤以石家莊株、滄州株、保定株完全抗藥，而唐山株中度抗藥。故在石家莊、滄州和保定三地區(qū)應(yīng)完全停止使用該藥，在唐山地區(qū)應(yīng)慎用該藥。

地克珠利與妥曲珠利均屬三嗪類抗球蟲藥，曾因高效低毒被廣泛應(yīng)用，然而長期用藥已使雞球蟲產(chǎn)生了抗藥性，本次采集的石家莊分離株對地克珠利輕度抗藥，可配合其他抗球蟲藥繼續(xù)使用；保定株和唐山株對地克珠利中度抗藥，建議穿梭用藥，短期使用或與其他抗球蟲藥交替使用；滄州株對地克珠利完全抗藥，近期不宜使用。石家莊株、保定株、唐山株對妥曲珠利綜合判定為完全抗藥，不可選用妥曲珠利作為防治雞球蟲病藥物；滄州株對妥曲珠利中度抗藥，可穿梭用藥或配合其他藥物。

莫能菌素是聚醚類抗生素，具有促進(jìn)離子通過細(xì)胞膜的能力，石家莊株、滄州株、唐山株對莫能菌素表現(xiàn)出完全抗藥，不用其作為防治雞球蟲的藥物；保定株對莫能菌素中度抗藥，可配合其他藥物或者中草藥來防治雞球蟲病。

磺胺喹噁啉屬于磺胺類化學(xué)抗球蟲藥，雞球蟲容易對其產(chǎn)生抗藥性，治療過程中必須使用足夠劑量和連續(xù)用藥，石家莊株對磺胺喹噁啉完全抗藥，在這個地區(qū)應(yīng)該停用此藥，使敏感性得以恢復(fù)；滄州株、保定株對磺胺喹噁啉中度抗藥，不宜作為主要抗球蟲藥使用；唐山株對磺胺喹噁啉輕度抗藥，適宜繼續(xù)使用。

該結(jié)果為當(dāng)?shù)胤乐坞u的球蟲病，制定合理的用藥方案提供了有效的依據(jù)，從而減少了盲目用藥帶來的經(jīng)濟(jì)損失。