豬圓環(huán)病毒病的實(shí)驗(yàn)室診斷

李敏 秦立鑫

回顧養(yǎng)豬業(yè)30年，傳統(tǒng)傳染病如豬瘟、口蹄疫、豬丹毒等得到有效控制，而一些新發(fā)疾病藍(lán)耳病、副豬嗜血桿菌病、圓環(huán)病毒病等持續(xù)暴發(fā)，單一病原感染向多種疾病混合感染發(fā)展，疫病防控與診斷難度增加。圓環(huán)病毒病侵害豬的免疫系統(tǒng)、造成免疫抑制，打開了其他疾病入侵的門戶，對(duì)于這種疾病早期診斷確診、早期有效治療尤為重要。由于疾病復(fù)雜程度增高、獸醫(yī)僅憑臨床表現(xiàn)和病理解剖難以全面把握，文章綜述豬圓環(huán)病毒病常用實(shí)驗(yàn)室診斷方法，分析各種方法學(xué)優(yōu)、略勢(shì)。

1 圓環(huán)病毒概述

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus， PCV）屬于單股DNA圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，二十面體結(jié)構(gòu)、無囊膜、由衣殼蛋白和DNA組成，為已知的最小動(dòng)物病毒之一，分為I型（PCVl）和II型（PCV2）兩個(gè)型。PCV1基因大小為1759hp，PCV2分為兩個(gè)基因型、大小分別為1767-1768hp，PCV1和PCV2兩種基因型在核苷酸序列上相似度低于80%、但抗原之間仍存在交叉反應(yīng)。PCV1最早在1974年發(fā)現(xiàn)、被證明沒有致病性；PCV2于1997年被分離出來，可引起了淋巴細(xì)胞凋亡、APC遞呈抗原能力的減弱、同時(shí)降低了B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的機(jī)能。PCV2具有免疫抑制性，感染PCV2的豬一般都發(fā)生免疫缺陷，可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥、新生仔豬先天性震顫、豬皮炎腎炎綜合癥、呼吸系統(tǒng)綜合癥、母豬繁殖障礙等。

2 病原學(xué)診斷

2.1 病毒的分離與鑒定

圓環(huán)病毒傳播主要以糞口途徑為主，病毒先定居于扁桃體、之后隨血液遍布全身淋巴結(jié)及各個(gè)器官組織，可取病死豬的脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)等作為病原的分離材料。將取材進(jìn)行研磨離心、氯仿抽提，接種于PK15細(xì)胞。PK15為豬腎細(xì)胞，圓環(huán)病毒可在PK15細(xì)胞上良好生長(zhǎng)而不產(chǎn)生細(xì)胞病變，培養(yǎng)過程中可加入D-氨基葡萄糖能夠促進(jìn)病毒的增殖，細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行傳代1～3次后應(yīng)進(jìn)行PCV2抗原或核酸的檢測(cè)加以鑒定。

2.2 問接免疫熒光法

間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)病毒的常用方法之一，通常以薄片作為載體、固定組織或細(xì)胞、再加入待檢標(biāo)本和熒光標(biāo)記物、在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。Allan等利用間接免疫熒光法來檢測(cè)圓環(huán)病毒II型，取病死豬的肺臟、淋巴結(jié)、腎臟等組織病料研磨離心處理后以蓋玻片為載體在PK15細(xì)胞上培養(yǎng)，丙酮固定，用熒光素標(biāo)記的兔抗高免血清與細(xì)胞培養(yǎng)物中的PCV2抗原反應(yīng)，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，可對(duì)PCV2進(jìn)行檢測(cè)和分型。該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及操作人員技術(shù)要求較高，專業(yè)實(shí)驗(yàn)室可操作、基層較難開展。

2.3 PCR

目前應(yīng)用于PCV檢測(cè)的PCR實(shí)驗(yàn)方法主要包括常規(guī)PCR方法、多重PCR方法、巢式PCR方法等。在PCR儀中熱穩(wěn)定的DNA聚合酶可使短鏈的雙股靶DNA很快地復(fù)制成千上萬倍，可以使DNA數(shù)量急劇增長(zhǎng)而達(dá)到檢測(cè)極限。理論上，可在2h內(nèi)將一個(gè)DNA分子擴(kuò)增到106～109倍，從而大大提高了對(duì)其進(jìn)行分析研究的速度。呂艷麗等根據(jù)PCV的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異的PCR引物進(jìn)行PCV檢測(cè)，建立了特異的PCV診斷方法，該方法可以檢測(cè)細(xì)胞和組織中的病毒核酸。王忠田等利用PCR技術(shù)對(duì)發(fā)病的規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行了PCV感染的調(diào)查，同時(shí)利用該方法研究了PCV病毒在自然感染豬體內(nèi)的分布情況。多重PCR是一種特殊的PCR檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)多種病毒DNA，即在同一反應(yīng)體系中加入不同病毒引物、擴(kuò)增不同的目標(biāo)片段，例如圓環(huán)病毒一偽狂犬病毒一細(xì)小病毒三聯(lián)檢。

3 血清學(xué)診斷

人工感染試驗(yàn)證明，由PCV2引起的血清轉(zhuǎn)換發(fā)生于感染后14～28d，所以抗體檢測(cè)有一段時(shí)間的窗口期。另外，PCV1和PCV2之間存在抗原交叉反應(yīng)，所以制備針對(duì)PCV2的單克隆抗體是血清學(xué)鑒定的前提條件。

3.1 間接免疫熒光

將PCV2抗原與熒光素（異硫氰酸）進(jìn)行結(jié)合，制備出熒光素標(biāo)記抗原，在反應(yīng)板上加入待檢標(biāo)本，如存在PCV2抗體則產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下可觀察。如有待見盧銀華等用豬腎傳代細(xì)胞系PK-15增殖豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）毒株制備抗原，建立了檢測(cè)PCV抗體的間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）。應(yīng)用該方法對(duì)64份臨床送檢血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果38份血清呈現(xiàn)PCV抗體陽性（59%）。但間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法對(duì)操作技術(shù)要求高、需要專門的熒光顯微鏡、需要有有經(jīng)驗(yàn)的檢測(cè)人員、缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的商業(yè)試劑盒，因此該方法的大范圍臨床應(yīng)用受到了限制。

3.2 乳膠凝集實(shí)驗(yàn)（LAT）

將PCV病毒致敏乳膠顆粒，制備成診斷抗原，取血清或全血標(biāo)本，可在現(xiàn)場(chǎng)圈舍旁邊檢測(cè)抗體，主要是檢測(cè)IgM，使用于感染早期診斷。該實(shí)驗(yàn)方法操作容易、實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單、3～5min出現(xiàn)結(jié)果、肉眼判斷、不需要專門培訓(xùn)、價(jià)格低廉、適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，在臨床檢驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。

3.3 ELISA

將病毒、純化的蛋白質(zhì)等抗原包被在酶聯(lián)板上，通過間接法、競(jìng)爭(zhēng)法等程序檢測(cè)抗體。檢測(cè)方法具有診斷速度快，敏感性高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模檢測(cè)的要求。有人用PCV2抗原包被96孔酶標(biāo)板，PCV2單克隆抗體作為酶結(jié)合物，采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)PCV2抗體。該實(shí)驗(yàn)與傳統(tǒng)的間接免疫熒光發(fā)相比較檢測(cè)同樣標(biāo)本，ELISA法敏感性達(dá)到99.6%，而間接免疫熒光法只有97%。張志慧等對(duì)市場(chǎng)上5種ELISA試劑盒性能做了蘋果，發(fā)現(xiàn)差異較大。分析為各試劑盒原料、工藝有較大差異，方法學(xué)有競(jìng)爭(zhēng)法有夾心法、原料上有基因合成的PCV2-cap、有重組的PCV2-cap，酶標(biāo)抗體有單克隆抗體有多克隆抗體。

中國(guó)獸藥監(jiān)察所對(duì)上市的幾種抗體檢測(cè)試劑做了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)特異性均達(dá)到87%以上，但敏感性從58%到100%不等。