HPLC法測定錦燈籠果實中5種黃酮類成分含量

王志穎，宗穎，孫佳明，杜銳，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117）

HPLC法測定錦燈籠果實中5種黃酮類成分含量

王志穎1，宗穎1，孫佳明2，杜銳1，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117）

建立同時測定錦燈籠果實中5種黃酮類成分的高效液相色譜方法，為以后的錦燈籠質(zhì)量評價研究做鋪墊，并對5個不同產(chǎn)地的錦燈籠果實中黃酮含量進行測定。采用HPLC法，流動相甲醇-水，梯度洗脫；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；檢測波長350 nm。結(jié)果表明5種黃酮類成分的線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性良好，符合測定要求。采用高效液相色譜法測定錦燈籠果實中5種黃酮類成分方法簡便、準確，對5個不同產(chǎn)地樣品測定結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

錦燈籠果實；高效液相色譜；黃酮

錦燈籠（Physalis alkekengi，L.var.francheti（Mast.）Makino）又名酸漿、掛金燈、燈籠果、紅姑娘等，為茄科（Solanaceae）酸漿屬植物，在俄羅斯、韓國、中國、日本以及朝鮮等國家都有生長，廣泛分布于歐亞大陸［1-3］。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，被列為中品［4］。錦燈籠的根，全草及果實均可入藥，其果實性味甘，有清涼解毒，消腫止痛，利尿，止咳，化痰之功效［5-6］。作為我國的傳統(tǒng)中藥，現(xiàn)代研究表明，錦燈籠有多方面的藥理作用［7-10］。錦燈籠中含有的黃酮類化合物種類較多，具有較好的生物活性，對錦燈籠質(zhì)量評價具有較大的意義［11-12］。

本實驗以木犀草苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素5種黃酮類化合物為指標，采用超聲輔助溶劑提取法對樣品進行處理，建立高效液相色譜法同時檢測5種黃酮含量的條件，并檢測了5個不同產(chǎn)地樣品中黃酮含量，測定結(jié)果穩(wěn)定，準確。

1材料與方法

1.1材料

錦燈籠果實由宗穎老師提供，鑒定為茄科（Solanaceae）酸漿屬植物錦燈籠（Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino）。

木犀草苷（0724-200806）、蘆?。?0008-200707）、槲皮苷（10183-201009）、槲皮素（11082-200705）、木犀草素（10008-200903）均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純）：美國Fisher公司；乙醇（分析純）：北京化工廠。

1.2儀器與設(shè)備

LC-2010液相色譜儀（SPD-20Avp紫外檢測器、柱溫箱、化學(xué)工作站）、UV2450紫外-可見分光光度計：日本島津公司；Nucleosil C18ODS色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）：大連依利特公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1對照品溶液的制備

精密稱定木犀草苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素各10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容，制成混合對照品溶液。

1.3.2樣品溶液的制備

準確稱取錦燈籠果實樣品10.0 g于250 mL錐形瓶中，取90%乙醇150mL，超聲提取3次，每次30min，合并提取液，濃縮至干，用甲醇定容于10 mL容量瓶，制成樣品溶液，測定前用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3.3色譜條件

Nucleosil C18ODS色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）和水（B）；梯度洗脫：0～15 min 35%～40%（A），15 min～30 min 40%～50%（A），30 min～40 min 50%～55%（A）；檢測波長：350 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL。

1.3.4標準曲線的制備

精密移取1.3.1項的混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，分別置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，得到不同濃度的混合對照品溶液，采用1.3.3項液相條件，測定5種黃酮峰面積，以各濃度為橫坐標（x）、積分面積值為縱坐標（y），進行線性回歸計算，得混合標準品溶液中5種黃酮的回歸方程。

2結(jié)果與分析

2.1混合對照品及錦燈籠樣品色譜峰

混合對照品色譜峰見圖1，錦燈籠樣品色譜峰見圖2。

2.2混合標準品中5種黃酮的線性回歸方程

5種黃酮的線性回歸方程見表1。

以黃酮濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，得到標準曲線。本方法測定錦燈籠果實中木樨草苷、蘆丁、槲皮素苷、槲皮素、木樨草素，線性關(guān)系良好。

圖1　混合標準品色譜峰Fig.1HPLC chromatograms of mixed standard

圖2　錦燈籠樣品色譜峰Fig.2HPLC chromatograms of sample

表1　5種黃酮的線性回歸方程Table 1Regression equations with correlation coefficients of 5 flavonoid

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度實驗

按“1.3.3”條件，取黃酮混合標準品連續(xù)進樣6次，測定得到峰面積，計算木犀草苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素峰面積的RSD值分別為1.32%、1.71%、0.96%、1.08%、1.19%（n＝6），表明精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性實驗

取黃酮混合標準品，按“1.3.3”條件，分別于0、0.5、1、1.5、2.0、2.5h進行測定。結(jié)果表明，標準品溶液色譜峰面積無明顯變化，計算木犀草苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素峰面積的RSD值分別為2.41%、1.69%、1.03%、2.11%、1.33%（n＝6），表明穩(wěn)定性良好。

2.3.3重復(fù)性實驗

取同一錦燈籠樣品溶液，按“1.3.3”條件下連續(xù)進樣6次，測定得到峰面積，計算木犀草苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素峰面積的RSD值分別為1.13%、1.17%、2.07%、1.59%、2.52%（n＝6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.3.4加樣回收率實驗

精密量取標準品溶液與6份已知各黃酮含量的錦燈籠樣品溶液混合，濃縮至干，定容，按“1.3.2”項操作，在“1.3.3”條件下進行測定。結(jié)果見表2。

表2　5種黃酮的加標回收率實驗結(jié)果（n＝6）Table 2Recovery rates of 5 flavones in a known sample（n＝6）

結(jié)果表明，本實驗提取和處理方法對錦燈籠種黃酮類成分的回收率介于99%～103%，符合測定要求。

2.4不同產(chǎn)地錦燈籠中黃酮的含量測定

5種不同產(chǎn)地錦燈籠果實中黃酮含量見表3。

表3　5種不同產(chǎn)地錦燈籠果實中黃酮含量Table 3Contents of flavones in Physalis alkekengi L.var.franchetii from 5 different area

在不同產(chǎn)地的錦燈籠果實黃酮含量測定中發(fā)現(xiàn)，在距離較近的地區(qū)，黃酮含量差異較小，但長春地區(qū)錦燈籠中黃酮含量較高，在吉林和通化地區(qū)黃酮含量較低，而且吉林和通化錦燈籠中黃酮含量相差也較大。

3討論與結(jié)論

錦燈籠中的黃酮類成分熱穩(wěn)定性較差，為了不破壞錦燈籠中的待測成分，采用超聲提取法，在室溫條件下對錦燈籠進行提取。在此條件下制備的樣品溶液在測定指標區(qū)域內(nèi)峰型簡單，沒有其他成分干擾。

對于錦燈籠中的黃酮類成分測定方法較多，主要采用紫外分光光度法測定，或是采用HPLC法對錦燈籠中單一成分進行含量測定［13-14］。在前人的工作的基礎(chǔ)上，綜合其他植物中黃酮類成分的測定方法，建立了HPLC法同時測定錦燈籠中的5種黃酮類成分的條件，具有分離度好，準確性高，方法簡便可行，不僅為以后錦燈籠果實的化學(xué)成分研究提供了很好的理論依據(jù)，同時也為錦燈籠在食品控制和質(zhì)量評價上建立了較好的方法。

采用本實驗建立的方法對不用產(chǎn)地的錦燈籠果實中黃酮進行了含量測定，結(jié)果顯示，長春地區(qū)的錦燈籠果實的黃酮含量較高，為以后的錦燈籠進一步研究提供參考。

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HPLC Determination of 5 Flavones in Physalis alkekengi，L.var.

WANG Zhi-ying1，ZONG Ying1，SUN Jia-ming2，DU Rui1，*
（1.Jilin Agricutural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China）

A high performance liquid chromatography method was established to simultaneously determine 5 flavones，Physalis alkekengi，L.var.fruit quality evaluation research is made later，and Contents of flavones from 5 different area is determined。5 flavones were separated by HPLC，with amobile phasecomposed of acetonitrile and water at a flow rate of 1.0 mL/min through gradient elution.The detection wavelength was 350 nm.An excellent linear relationship between peak areas and concentrations of 5 flavones is established.By high performance liquid chromatography determination of 5 kinds of flavonoids in Physalis alkekengi，L.var.fruit composition method is simple and accurate，and 5 different origin samples determination result is stable and reproducible.

Physalis alkekengi，L.var.fruit；HPLC；flavonoid

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.023

2014-03-04

吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（吉教科合字［2012］第50號）

王志穎（1991—），女（漢），碩士研究生，主要從事中藥有效成分的研究與開發(fā)利用的研究工作。

杜銳（1971—），男（漢），教授，博士，主要從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。