一氧化碳釋放分子-2對(duì)小鼠急性肝功能衰竭保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

顏炳柱 王曉韌 許磊 朱安超 楊寶山 劉冰熔

·論 著·

一氧化碳釋放分子-2對(duì)小鼠急性肝功能衰竭保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

顏炳柱 王曉韌 許磊 朱安超 楊寶山 劉冰熔

目的 探討一氧化碳釋放分子-2對(duì)小鼠急性肝功能衰竭（ALF）的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 雄性C57BL/6小鼠30只隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和保護(hù)組，每組10只。通過(guò)一次性腹腔注射脂多糖/D-氨基半乳糖（LPS/D-GalN）構(gòu)建小鼠ALF的動(dòng)物模型，CORM-2于造模前30min行尾靜脈注射，造模后6h分別留取血清、肝組織標(biāo)本。生化分析儀檢測(cè)血清中ALT、AST水平，HE觀察肝臟病理改變，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中TNF-α和IL-6的水平，反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)肝組織中TNF-α和IL-6mRNA的表達(dá)。結(jié)果 保護(hù)組小鼠血清ALT［（1274.60±157.24）U/L比（3499.00±136.19）U/L］和AST［（1151.50±244.58）U/L比（4079.50±481.11）U/L］水平均明顯低于模型組（均t1=33.81，t2=17.16，P＜0.05）；與模型組比較，保護(hù)組肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肝細(xì)胞壞死程度明顯減輕［（0.14±0.05）比（0.37±0.05），t=10.29，P＜0.05］；保護(hù)組小鼠血清和肝組織中TNF-α［（139.60±28.39）pg/mL比（447.34±128.17）pg/mL、（0.31±0.03）比（0.69±0.05）］和IL-6［（215.21±85.16）pg/mL比（1461.58±244.90）pg/mL、（0.33±0.03）比（0.72±0.05）］表達(dá)水平明顯低于模型組（均t1=7.41，t2=20.61，t3=15.20，t4=21.15，P＜0.05）。結(jié)論

急性肝衰竭；一氧化碳釋放分子-2；炎癥；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-6

急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是由多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，具有較高的病死率，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，也缺乏有效的藥物治療［1-2］。因此，探討對(duì)ALF的新的治療措施具有重要的研究?jī)r(jià)值和臨床意義。研究證實(shí)，CO 作為機(jī)體內(nèi)一種重要的細(xì)胞信使分子，具有極其重要的生物學(xué)功能，如抗炎、抗凋亡和細(xì)胞保護(hù)作用［3］。一氧化碳釋放分子-2（tricarbonyldichlororuthenium II dimmer，CORM-2）是近年來(lái)新合成的一種CO復(fù)合物，經(jīng)適當(dāng)溶劑溶解后能夠提供外源性CO分子，較CO氣體而言，其濃度相對(duì)容易控制并且又能夠使碳氧血紅蛋白保持在較低水平［4］。本研究采用脂多糖（LPS）和D-氨基半乳糖（D-GalN）構(gòu)建急性肝衰竭動(dòng)物模型，并給予CORM-2進(jìn)行預(yù)保護(hù)，旨在探討其可能的作用機(jī)制。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

（一）動(dòng)物 健康雄性C57BL/6小鼠，8～10周齡，體質(zhì)量20～22 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK京2012-0001），清潔級(jí)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前12 h開(kāi)始禁食。

（二）試劑和儀器CORM-2、LPS和 D-Gal N購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；二甲基亞楓（DMSO）購(gòu)于Sigma公司；二氨基聯(lián)苯胺染色試劑盒（DAB）購(gòu)于武漢博士德公司；TNF-α和IL-6ELISA檢測(cè)試劑盒為BG公司；Taq酶、RT-PCR試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀（Gene Amp PCR System 9700，美國(guó)），全自動(dòng)生化分析儀（Dimension○REXLTMwith LM，SIEMENS）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）動(dòng)物模型與分組將30只小鼠按照隨機(jī)原則分為對(duì)照組、模型組和保護(hù)組，每組10只。模型組和保護(hù)組一次性腹腔注射LPS（100μg/kg）和D-GalN（800mg/kg），保護(hù)組于造模前30min予以CORM-2（8mg/kg）尾靜脈注射，而模型組、對(duì)照組分別注射同等體積0.9％氯化鈉溶液作為對(duì)照，各組分別于給藥后6h采集血清和肝組織標(biāo)本。

（二）肝功能檢測(cè)小鼠去眼球后靜脈采血，靜止30min，3500r/min離心（r=8cm）15min后取上清液；應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀分析ALT和AST水平，判斷肝臟功能改變情況。

（三）肝組織學(xué)檢測(cè)采血取樣后迅速斷頸處死小鼠，無(wú)菌取肝臟組織，4％多聚甲醛液固定，石臘包埋、切片，5μm厚，按試劑盒說(shuō)明書操作，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)改變。肝臟組織病理學(xué)評(píng)分按照以往文獻(xiàn)進(jìn)行［5］。

（四）血清TNF-α和IL-6測(cè)定收集各組小鼠血清，應(yīng)用肝素抗凝后，室溫靜置30min，離心，取上清液，-20℃保存，具體按ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

（五）肝組織中TNF-α和IL-6mRNA檢測(cè)取肝臟組織100mg，應(yīng)用Trizol試劑盒參照說(shuō)明提取總RNA，用紫外分光光度法測(cè)定所提取總RNA含量，各標(biāo)本總RNA經(jīng)定量后，取1μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系20μL，42℃15min，95℃5min，4℃5min。取cDNA1.5μL進(jìn)行擴(kuò)增PCR，反應(yīng)體系25μL，反應(yīng)條件均為：94℃2min；96℃15s，62℃20s，70℃1min，35個(gè)循環(huán)；70℃5min。采用Primer5.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程公司合成引物，具體見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，紫外線分析儀下觀察、攝片用Quantity-One4.31軟件進(jìn)行條帶掃描半定量分析，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，目的基因相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶密度/GAPDH基因條帶密度。

表1 引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、CORM-2對(duì)血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

與正常組比較，模型組血清ALT和AST水平明顯升高；給予CORM-2干預(yù)后，ALT和AST水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1=33.81，t2=17.16，P＜0.05），見(jiàn)表2。

二、病理學(xué)改變

正常組：肝組織染色均勻，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞核形態(tài)正常，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及凋亡和壞死現(xiàn)象。模型組：可見(jiàn)肝組織呈灶狀或片狀壞死，肝細(xì)胞明顯水腫和疏松化，肝竇內(nèi)充血、擴(kuò)張明顯，匯管區(qū)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。保護(hù)組：肝臟組織病變較輕，肝細(xì)胞壞死面積較少、呈散在碎片狀，壞死區(qū)可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。肝臟組織病理學(xué)評(píng)分比較，模型組與保護(hù)組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.29，P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

表2 各組轉(zhuǎn)氨酶、病理學(xué)評(píng)分比較（-x±s）

三、TNF-α和IL-6血清水平變化

與正常組比較，模型組血清TNF-α和IL-6水平明顯升高；給予CORM-2干預(yù)后，TNF-α和IL-6水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1=7.41，t2=20.61，P＜0.05），見(jiàn)表3。

四、肝組織TNF-α和IL-6mRNA表達(dá)

正常小鼠肝組織表達(dá)極少量的TNF-α和IL-6mRNA；模型組表達(dá)量明顯增高；保護(hù)組給予CORM-2干預(yù)后，TNF-α和IL-6mRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t3=15.20，t4=21.15，P＜0.05）。見(jiàn)圖2，表3。

圖1 各組小鼠肝組織病理改變（HE染色，×200）

表3 各組血清和肝組織中TNF-α和IL-6表達(dá)水平的比較（-x±s）

圖2 各組小鼠肝組織TNF-α和IL-6表達(dá)

討論

ALF的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，目前治療措施尚未能完全阻止肝衰竭的進(jìn)展，因此探索肝衰竭的發(fā)病機(jī)制及防治措施，具有重要的意義及廣闊的應(yīng)用前景。研究證實(shí)TNF-α，IL-6等炎性細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)式釋放是ALF發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，不僅與肝細(xì)胞損傷密切相關(guān)，而且可直接反應(yīng)肝臟炎性損傷程度［6-7］。因此，抑制TNF-α、IL-6促炎細(xì)胞因子的釋放可能成為臨床救治ALF的策略［8-9］。

CO作為機(jī)體內(nèi)重要的氣體信號(hào)分子，以往研究重點(diǎn)多集中在其毒理方面，但越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)CO還具有抗炎、抗凋亡、擴(kuò)張血管等多種生物學(xué)功能［10-12］。而外源性CO干預(yù)小鼠急性肝功能衰竭的研究目前較少，主要是因?yàn)橥庠葱訡O的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)其操作難度大，濃度不宜控制，且容易發(fā)生中毒，實(shí)際應(yīng)用中受到了限制。CORM作為一種新合成的新型金屬羰基化合物，經(jīng)適當(dāng)溶劑溶解后可在機(jī)體內(nèi)緩慢、持續(xù)、可控地釋放CO，并能夠模擬內(nèi)源性CO在體內(nèi)產(chǎn)生的病理生理過(guò)程［13］。其中CORM-2是目前被用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)最多的一類CO釋放分子，溶于DMSO時(shí)能夠釋放CO，而且不升高動(dòng)物體內(nèi)碳氧血紅蛋白濃度，不致使動(dòng)物發(fā)生CO中毒，受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。在多種動(dòng)物模型中，研究證實(shí)CORM-2能夠釋放CO并且具有保護(hù)肝臟、肺臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等重要器官的作用［14-17］。

本研究表明，給予LPS/D-GalN后小鼠ALT、AST水平明顯升高，而CORM-2干預(yù)后能夠極大地降低轉(zhuǎn)氨酶水平。此外，對(duì)肝組織學(xué)的觀察發(fā)現(xiàn)CORM-2顯著抑制了LPS/D-GalN誘導(dǎo)ALF肝組織內(nèi)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、出血和壞死，這說(shuō)明CORM-2有助于減輕肝細(xì)胞的損傷程度。CORM-2不僅抑制血清中TNF-α和IL-6水平，而且也抑制肝組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)，提示CORM-2能夠抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，從而減輕肝細(xì)胞的損傷。

綜上所述，CORM-2對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠ALF進(jìn)行干預(yù)，能夠改善ALF時(shí)肝損傷程度，對(duì)小鼠ALF具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與CORM-2減輕肝臟炎性反應(yīng)有關(guān)。

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An experimental study in protective effect of CORM-2 on acute liver failure in mice

YAN Bing-zhu，WANG Xiaoren，XV Lei，ZHU An-chao，YANG Bao-shan，LIU Bing-rong.Department of Infectious Diseases，the Second Clinical Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China

Objective To investigate the protective effect and mechanisms of carbon monoxide releasing molecule （CORM-2）on acute liver failure（ALF）in mice.Methods Male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups：control，model and protected group.The ALF animal models were induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide/D-galactosamine（LPS/D-GalN）.CORM-2 was administered via tail vein 30 minutes before LPS/D-GalN treatment.All serum samples and liver specimens were collected for detection in 6 hours after the administration of LPS/DGal N.The serumLevels of alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）were measured by automatic biochemical analyzer.The liver pathologic changes were observed by light microscopy using hematoxylin and eosin （HE）staining.The serumLevels of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-6（IL-6）were measured by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression of TNF-αand IL-6 mRNA in the liver tissues were measured by reverse transcript polymerase chain reaction（RT-PCR）in each group.Results The serumLevels of ALT ［（1274.60± 157.24）U/L vs（3499.00±136.19）U/L］and AST［（1151.50±244.58）U/L vs（4079.50±481.11）U/L］in protected group were significantly lower than those in model group（t1=33.81，t2=17.16 both P＜0.05）.Massive inflammatory cells infiltration and hepatocyte necrosis were widely spread in model group，while liver injuries were obviously relieved in protected group［（0.14±0.05）vs（0.37±0.05），t=10.29，P＜0.05］.The serumLevels of TNF-α［（139.60±28.39）pg/mL vs（447.34±128.17）pg/mL］and IL-6［（215.21±85.16）pg/mL vs（1461.58±244.90）pg/mL］in protected group were significantly reduced compared with model group（t1=7.41，t2=20.61 both P＜0.05）.TNF-αm RNA［（0.31±0.03）vs（0.69±0.05）］and IL-6 mRNA ［（0.33±0.03）vs（0.72±0.05）］measured by RT-PCR in live tissues of protected group were also significantly lower than that in model group（both P＜0.05）.Conclusion CORM-2 could remarkably inhibit the inflammatory activity and attenuate liver injury，mechanism of which might be related to inhibiting the release of proinflammatory cytokines TNF-αand IL-6.

Acute liver failure；CORM-2；Inflammation；Tumor necrosis factor-α；Interleukin-6

2015-02-06）

（本文編輯：賴榮陶）

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究資助項(xiàng)目（12531294）

150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染科（顏炳柱，王曉韌，楊寶山），醫(yī)務(wù)部（許磊），消化內(nèi)科（劉冰熔）；哈爾濱市第一醫(yī)院病理科（朱安超）

劉冰熔，Email：liubingrong@ medmail.com.cn

CORM-2能夠抑制小鼠ALF時(shí)的炎性反應(yīng)，減輕肝臟病理?yè)p傷，其機(jī)制可能與抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的釋放有關(guān)。