響應(yīng)面法優(yōu)化姜黃素的提取工藝及其抗氧化活性的研究

張　艷，段雪芹，高　剛，茍學(xué)梅，王　茜，鄧家彬，周永紅，楊瑞武，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川溫江611130）

響應(yīng)面法優(yōu)化姜黃素的提取工藝及其抗氧化活性的研究

張艷1，段雪芹1，高剛1，茍學(xué)梅1，王茜1，鄧家彬1，周永紅2，楊瑞武1，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川溫江611130）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化了姜黃素的提取工藝，并探討了姜黃素對超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）、DPPH自由基、ABTS+自由基的體外抗氧化活性。姜黃素的最佳提取工藝條件為乙醇濃度85%，超聲時(shí)間50min，液料比20∶1（mL/g）。在此條件下，姜黃素得率為1.538%。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，三種姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品具有較強(qiáng)的抗氧化活性且各有差異，姜黃素提取液對超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）、DPPH自由基、ABTS+自由基也具有較強(qiáng)的清除能力。

姜黃，提取，姜黃素，抗氧化活性

姜黃（Curcuma longa）為多年生草本植物，用藥歷史悠久，中藥郁金、莪術(shù)和姜黃均來源于該屬植物。中醫(yī)認(rèn)為其性辛，味溫苦，可作調(diào)味品、天然色素和染料［1］，同時(shí)還具有較好的抗氧化、抗腫瘤、抗艾滋病毒等生物活性［2-3］。姜黃的主要活性成分是姜黃素類化合物，主要包括姜黃素（curcumin）、去甲氧基姜黃素（DMC）和雙去甲氧基姜黃素（BDMC）。近年來，姜黃素已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，涉及的領(lǐng)域也越來越廣泛。因而，從中草藥中提取和分離姜黃素受到許多機(jī)構(gòu)的垂青［4-8］。目前，國內(nèi)大多數(shù)姜黃屬植物姜黃素含量普遍偏低，制取純度高的工藝體系還達(dá)不到優(yōu)化，且成本高，生產(chǎn)利潤低。為此，本研究以國內(nèi)四川地區(qū)的姜黃為研究對象，采用超聲波輔助法提取總姜黃素，在單因素基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析篩選最佳工藝條件，并采用HPLC法測定其含量，同時(shí)比較三種姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品及姜黃素提取液的體外抗氧化活性，為國內(nèi)姜黃屬藥用植物的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

姜黃采自四川地區(qū)，現(xiàn)種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場，采集姜黃塊根洗凈，于65℃干燥箱中烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，備用；姜黃素對照品購于中國生物制品藥品檢定所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2-2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LV-10AVP高效液相色譜儀（由DGU-12A脫氣機(jī)，兩個(gè)LC-10ATVP溶劑輸送泵、SPD-10AVP紫外-可見檢測器、SCL-10AVP系統(tǒng)控制器、SIL-10ADVP自動進(jìn)樣器、混合器和柱溫箱以及LCsolution工作站組成），色譜柱為Dima C18（5μm，4.6mm×150mm）、UV-1750可見-紫外分光光度計(jì)日本島津；FA1004電子分析天平上海振興化工一廠；GSY-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋北京市醫(yī)療設(shè)備廠102微型植物粉碎機(jī)天津泰斯特儀器有限公司；SZ-97自動二重純水整流器上海亞榮生化儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取工藝取細(xì)粉約0.1g，精密稱定后，置5m L離心管中，40W超聲提取，12000r/m in離心4m in，重復(fù)3次，合并收集上清液并定容至100m L。將提取液過0.45mm微孔濾膜，取續(xù)濾液定容備用［9］。采用HPLC法［10］測定姜黃素含量。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1乙醇濃度對姜黃素得率的影響在液料比20∶1（m L∶g），40W超聲提取30m in的條件下，研究40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%不同乙醇濃度對姜黃素得率的影響。

1.2.2.2超聲時(shí)間對姜黃素得率的影響超聲功率為40W，乙醇濃度80%，液料比20∶1條件下，研究5、10、20、30、40、50、60、70m in不同超聲時(shí)間對姜黃素得率的影響。

1.2.2.3液料比對姜黃素得率的影響在乙醇濃度為80%，40W超聲時(shí)間30m in條件下，研究3∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1m L/g不同液料比對姜黃素得率的影響。

1.2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素的基礎(chǔ)上根據(jù)CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取乙醇濃度，超聲時(shí)間，液料比對總姜黃素得率的影響較大的3個(gè)因素作響應(yīng)面分析。實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1　響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1　Independent variables and their levels used in the central composite design（CCD）

1.2.4HPLC法測定姜黃素含量色譜柱為Dima C18（5μm，4.6mm×150mm）流動相B為乙腈溶劑，流速為0.9m L/m in；柱溫40℃，檢測波長為422nm，進(jìn)樣量為10μL。

取BDMC、DMC、Cur標(biāo)準(zhǔn)品精密稱取各5mg，以無水乙醇溶解，定容到50m L，然后分別配制成102μg/m L溶液，棕色瓶中于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。在上述色譜條件下，精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液10μL注入色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖峰面積和回歸方程計(jì)算姜黃素含量及得率。

依次取10、20、30、40、50μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。在回歸方程y=ax+b中，x代表進(jìn)樣量（μg），為橫坐標(biāo)，y代表峰面積，為縱坐標(biāo)。

1.2.5總姜黃素體外抗氧化活性

1.2.5.1O2-·的抑制能力的測定具體步驟參照Beauchamp［11］與Zhishen等［12］的方法。用0.05mol/L pH= 7.4的PBS緩沖液為溶劑，配制3.3×10-6mol/L核黃素，0.01mol/L蛋氨酸，4.6×10-5mol/L氯化硝基四氮唑蘭（NBT）。取上述3種溶液各2.0m L，加入各種濃度的姜黃素溶液1.0m L，空白管以1.0m L緩沖液代替樣品溶液。光照30m in，560nm處測吸光度。3次重復(fù)。計(jì)算清除率。

超氧陰離子自由基清除率（%）=（A0-A）/A0×100

式中，A0：空白管的吸光度，A：為各姜黃素的吸光度。

1.2.5.2 ·OH清除能力的測定1m L姜黃素溶液依次加入2m L 6mmol/L FeSO4、2m L 6mmol/L H2O2，混勻，靜置10m in，再加入6mmol/L水楊酸2m L，混勻，靜置30m in，510nm處測其吸光度（Ai），蒸餾水代替水楊酸、姜黃素溶液測其吸光度Aj、A0。以VC做陽性對照，重復(fù)3次。計(jì)算清除率。

1.2.5.3DPPH自由基清除能力的測定參照Blois，Choi et al.，Su等［13-15］方法，5m L 0.03g/L的DPPH甲醇溶液，加上0.05m L姜黃素溶液。暗箱反應(yīng)30m in后，517nm測吸光值。重復(fù)3次，計(jì)算清除率。

式中，A0：空白溶液吸光值（沒有加姜黃素溶液），A1：姜黃素溶液吸光值。

1.2.5.4ABTS+自由基清除能力的測定參照Shirwaikar和Re［16-17］的方法，將等量的7mmol/L ABTS+溶液與2.45mmol/L過硫酸鉀（K2S2O8）混合并置于暗處12～16h。甲醇稀釋ABTS+至其在734nm處吸光度為0.7±0.02。將姜黃素溶液加入2m L ABTS+6m in后測吸光度（Ai），2m L ABTS+和25μL甲醇混合后517nm處測吸光度（A0）；2m L甲醇溶液與25μL樣品液混合測吸光度（A1），計(jì)算：

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1乙醇濃度對姜黃素得率的影響由圖1可知，隨著乙醇濃度增加，姜黃素得率逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度超過80%后姜黃素得率開始下降，因此，乙醇濃度選擇80%比較適宜。

2.1.2超聲時(shí)間對姜黃素得率的影響由圖2可知，隨著超聲時(shí)間延長，姜黃素得率逐漸升高，在超聲時(shí)間為50m in時(shí)，姜黃素得率最高，因此，超聲時(shí)間選擇50min比較適宜。

圖1　乙醇濃度對姜黃素得率的影響Fig.1　The curcuminoids extraction yield effects by ethanol concentration

圖2　超聲時(shí)間對姜黃素得率影響Fig.2　The curcuminoids extraction yield effects by ultrasonic time

2.1.3液料比對姜黃素得率的影響由圖3可知，在3∶1～20∶1時(shí)，隨著液料比的增加，姜黃素得率呈上升趨勢，但液料比大于20∶1后，姜黃素得率逐漸下降。因此，液料比選擇20∶1比較適宜。

圖3　液料比對姜黃素得率的影響Fig.3　The curcuminoids extraction yield effects by liquid-to-material ratio

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化與分析

2.2.1響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用軟件Design Expert 8.05的CCD中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得最佳工藝參數(shù)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值表Table 2Experimental results and predicted for central composite design（CCD）

2.2.2回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)對表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合獲得二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=15.21+0.53A+0.57B+0.49C-0.47AB+0.39AC-0.53BC-0.74A2-0.54B2-0.49C2

對20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面方差分析，見表3。

表3　回歸方程方差分析表Table 3　Analysis of variance for COD removal

由表3可知，回歸模型是極顯著的（p＜0.01），且該模型有較高的相關(guān)系數(shù)（R2=0.9292）擬合度大于92.92%，失擬項(xiàng)不顯著，則該模型能夠反映響應(yīng)值的變化，對實(shí)驗(yàn)擬合情況好、誤差小，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.2.3響應(yīng)曲面分析圖4反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。由3組響應(yīng)面圖可知，姜黃素得率隨著其中兩因素的增加先上升，當(dāng)達(dá)到一定水平時(shí)，姜黃素得率增加緩慢，隨后下降。乙醇濃度與超聲時(shí)間之間的交互作用、乙醇濃度與液料比之間的交互作用及超聲時(shí)間與液料比之間的交互作用對姜黃素得率有顯著影響。

圖4　各兩因素交互影響姜黃素得率的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface of cross-interaction among two factors on the curcuminoids extraction yield

回歸模型預(yù)測總姜黃素得率最高時(shí)的乙醇濃度85.45%、超聲時(shí)間49.50m in、液料比18.54∶1，姜黃素得率15.45mg/g，即1.545%。按照該條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為方便操作乙醇濃度設(shè)為85%，超聲時(shí)間50m in，液料比20∶1，5次平行實(shí)驗(yàn)的姜黃素得率實(shí)測值1.538%與理論預(yù)測值基本吻合，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的超聲提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3HPLC法測定三種姜黃素含量

由圖5、圖6可知，3個(gè)顯著峰出現(xiàn)的時(shí)間相同，所以3個(gè)峰分別對應(yīng)相同物質(zhì)。由圖6可見1、2、3峰分別是Cur、DMC、BDMC。

圖5　三種姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品乙醇溶液的HPLC圖譜Fig.5　Typical HPLC chromatogram of three curcumin standards with ethanol solvent

圖6　姜黃素提取液的HPLC圖譜Fig.6　Typical HPLC chromatogram of the curcuminoids extract with ethanol solvent

由表4可見，這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品都呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。根據(jù)樣品的色譜圖峰面積和回歸方程得總姜黃素含量。

表4　3種姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程Table 4　Regression equations of three curcumin standards

2.4體外抗氧化活性

2.4.13種姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品的抗氧化活性由表5可知，3種姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品對4種自由基具有較強(qiáng)的清除作用，尤其BDMC對ABTS+的清除能力強(qiáng)于VC，同時(shí)Cur對DPPH·、·OH，DMC對ABTS+的清除作用也較強(qiáng)。所以3種姜黃素具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

表5　3種姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品及VC的4種抗氧化方法結(jié)果匯總Table 5　The in vitro antioxidantof three curcumin standards and VC

2.4.2姜黃素提取液的抗氧化活性由圖7可知，在1～8μg/m L時(shí)，姜黃素提取液對DPPH·、ABTS+·、·OH、O2-·的清除率隨質(zhì)量濃度增大而增大，且在1～3μg/m L時(shí)，姜黃素提取液對ABTS+·的清除率高于VC，在1～5μg/m L時(shí)，總姜黃素對·OH的清除率也高于VC。所以姜黃素提取液具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

圖7　姜黃素提取液與VC對4種自由基的清除效果Fig.7　Scavenging effects of curcuminoids extractand VCto four radicals

3　結(jié)論與討論

通過中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析得到了較優(yōu)的提取工藝條件：乙醇濃度85%，超聲時(shí)間50m in，液料比20∶1（m L/g），實(shí)際提取姜黃素得率1.538%，與預(yù)測值1.545%基本一致。高秀強(qiáng)等［18］采用加熱回流提取，HPLC法測定姜黃素含量，得率為1.325%。唐小清等［19］采用超聲提取，紫外分光光度法測定含量，得率為1.968%，提取率較高，經(jīng)分析得出，本實(shí)驗(yàn)采用鮮姜黃，姜黃素含量比干藥材姜黃小，且HPLC法測定的是姜黃素三種單體的含量總和，所以本實(shí)驗(yàn)得率1.538%較高，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

三種姜黃素單體抗氧化活性有差異，總體抗氧化活性較強(qiáng)。同時(shí)，姜黃素提取液在質(zhì)量濃度為1～8μg/m L時(shí)，對DPPH·、ABTS+·、·OH、O2-·有較強(qiáng)的清除能力，并且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。且在1～3μg/m L時(shí)，總姜黃素對ABTS+·的清除能力高于VC，在1～5μg/m L時(shí)，對·OH的清除能力也高于VC。實(shí)驗(yàn)證明，在一定濃度范圍內(nèi)，姜黃素提取液對DPPH·、ABTS+·、·OH、O2-·也具有較強(qiáng)的清除能力，所以從四川地區(qū)的姜黃中得到的姜黃素作為天然抗氧化劑具有進(jìn)一步開發(fā)利用的價(jià)值。

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Study on optim ization of extraction process for curcum inoids by response surface method and its antioxidant activity

ZHANG Yan1，DUAN Xue-qin1，GAO Gang1，GOU Xue-mei1，WANG Qian1，DENG Jia-bin1，ZHOU Yong-hong2，YANG Rui-wu1，*
（1.College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Triticeae Research Institute，Sichuan Agriculture University，Wenjiang 611130，China）

Response surface methodology was used to op tim ize the extraction p rocess for curcum inoids.The antioxidant activity of curcum inoids was evaluated using superoxide anion（O2-·），hyd roxyl（·OH），DPPH and ABTS+rad icalscavenging.The results ind icated that the op timalextraction cond itions were ethanolconcentration（V/V）85%，ultrasonic time 50m in，and material-to-liquid ratio 20∶1（m L/g）.Under these extraction cond itions，maximum yield of curcum inoids of 1.538%was ob tained.The antioxidant experiment in vitro demonstated that the antioxidant ac tivity of three curcum in standards were strong and different.Meanwhile the curcum inoids extrac talso have a better ability to scavenge superoxide anion（O2-·），hyd roxyl（·OH），DPPH and ABTS+radical.

Curcuma longa；extraction；curcum inoids；antioxidantac tivity

TS219

B

1002-0306（2015）06-0269-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.051

2014-07-03

張艷（1989-），女，碩士研究生，主要從事植物資源學(xué)方面的研究。

楊瑞武（1969-），男，博士，教授，主要從事植物系統(tǒng)與進(jìn)化方面的研究。

國家自然科學(xué)基金（31270243）。