基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)的牡蠣肉超高壓殺菌工藝條件優(yōu)化

王曉謙，鐘賽義，秦小明，鄭惠娜，章超樺

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)的牡蠣肉超高壓殺菌工藝條件優(yōu)化

王曉謙，鐘賽義，秦小明*，鄭惠娜，章超樺

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

為研究超高壓對(duì)牡蠣殺菌的影響，利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立數(shù)據(jù)集，以菌落總數(shù)為參考指標(biāo)，借助JMP7.0軟件的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，優(yōu)化牡蠣肉超高壓殺菌處理工藝條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牡蠣肉超高壓殺菌的最佳工藝條件為壓力350MPa，保壓時(shí)間20min，處理溫度30℃，在此條件下超高壓處理后的牡蠣肉菌落總數(shù)從3.2718lg cfu/g減少到2.44342lg cfu/g（滅菌率85.13%），大腸菌群從7MPN/100g減少至0。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有較好的預(yù)測(cè)能力，可準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)殺菌效果，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)誤差較?。?.201%）。

牡蠣，超高壓，殺菌，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

牡蠣又稱蠔、海蠣子，其營(yíng)養(yǎng)豐富，必需氨基酸種類齊全，同時(shí)含有豐富的糖原和牛磺酸，素有“海洋牛奶”的美稱。牡蠣屬濾食性雙殼動(dòng)物，在濾食藻類的同時(shí)，也會(huì)把水中的細(xì)菌及有害物質(zhì)吸入至體內(nèi)。近年來(lái)由于海洋環(huán)境不斷惡化，污染日益加重，食用牡蠣造成的食源性疾病的報(bào)道也越來(lái)越多。大量微生物的存在直接影響牡蠣的食用安全性，同時(shí)縮短了牡蠣保鮮期［1-2］。傳統(tǒng)的熱加工方法在殺菌的同時(shí)，不僅造成了牡蠣的感官品質(zhì)的下降（口感粗糙，失水等），同時(shí)也造成了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失。

超高壓技術(shù)是一種將食品原料包裝后密封于超高壓容器中，以水或其他流體介質(zhì)作為壓力傳遞媒介物，在100～1000MPa的靜高壓和適當(dāng)溫度下加工一定時(shí)間，達(dá)到食品滅菌、保藏和加工目的的新型食品加工技術(shù)［3］。超高壓加工食品有很多優(yōu)點(diǎn)：它是純物理過(guò)程，能夠最大程度地保持食品的原有成分，并易于被人體消化吸收，同時(shí)感官特性有了較大的改善；超高壓處理的食品沒(méi)有“回生”現(xiàn)象，滅菌效果好，便于長(zhǎng)期保存［4］。目前，應(yīng)用超高壓技術(shù)處理水產(chǎn)品使其達(dá)到滅菌效果的研究逐年增多，本研究擬在保證食品衛(wèi)生安全的條件下，對(duì)牡蠣肉進(jìn)行超高壓處理，最大程度的保持牡蠣肉原有的品質(zhì)、風(fēng)味、色澤，為牡蠣精深加工高值化利用探索一條新的途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）購(gòu)于湛江霞山東風(fēng)水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)；海水取自湛江東海島龍海天海濱的海水井；真空包裝袋（材質(zhì)：PE+PET雙層復(fù)合，厚度：雙面0.14mm） 河北新興塑業(yè)；平板計(jì)數(shù)瓊脂北京陸橋公司。

HPP.L2-600/0.6型超高壓設(shè)備天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；SJY-UV01G型紫外殺菌器廣州百諾環(huán)保技術(shù)有限公司；HY-002-2A型臭氧發(fā)生器廣州佳環(huán)電器科技有限公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SPX-150B-2型生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DZQ型單室真空封口機(jī)上海申越包裝機(jī)械制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1牡蠣的預(yù)處理

1.2.1.1海水的預(yù)處理海水靜置24h后抽濾，再經(jīng)過(guò)紫外殺菌器（10W，0.2T/h）進(jìn)行殺菌處理，制得無(wú)菌海水備用。

1.2.1.2牡蠣的預(yù)處理［5-6］選取長(zhǎng)度12～14cm的香港牡蠣，用海水洗凈表面泥沙及附著物后，放入預(yù)處理過(guò)的海水中，體積按照牡蠣∶水=1∶10，通入空氣，輔助臭氧（濃度0.05%）殺菌處理，凈化處理24h，每4h換一次無(wú)菌海水。凈化處理結(jié)束后人工開(kāi)殼取牡蠣肉，放入臭氧濃度為0.05%的冰生理鹽水中（4℃），洗去黏液及黑邊，瀝干表面水分后真空包裝。取樣進(jìn)行微生物檢測(cè)，牡蠣肉的菌落總數(shù)為3.2718g（cfu/g），大腸菌群為7MPN/100g。

1.2.2超高壓處理［7］為保證每組實(shí)驗(yàn)中微生物種類、數(shù)量一致，每次實(shí)驗(yàn)用牡蠣均一次性處理。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的牡蠣肉（12～15g/只）裝在真空包裝袋中（每袋2只），置于超高壓處理釜中，設(shè)定壓力為100、200、300、400、500MPa（升壓速度為30MPa/s），保壓時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30m in，溫度分別為20、30、40、50、60℃，做壓力單因素時(shí)，固定保壓時(shí)間為10min，處理溫度30℃；做保壓時(shí)間單因素時(shí)，固定處理壓力為300MPa，處理溫度30℃；做溫度單因素時(shí)，壓力為300MPa，保壓時(shí)間10m in。每個(gè)處理?xiàng)l件做3次平行。

1.2.3殺菌實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究中超高壓的殺菌效果以菌落總數(shù)對(duì)數(shù)（lg cfu/g）和大腸菌群（MPN/100g）為響應(yīng)指標(biāo)，考慮的主要因素包括處理壓力、保壓時(shí)間和處理溫度。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)來(lái)確定人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化需要輸入的訓(xùn)練數(shù)據(jù)，因素水平編碼表見(jiàn)表1［8-11］。

表1　因素水平編碼表Table 1　Code of factors and levels

1.2.4微生物檢測(cè)根據(jù)國(guó)家食品微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.2-2010）進(jìn)行菌落總數(shù)和大腸菌群的測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及作圖采用Origin 8.5和JMP 7.0數(shù)據(jù)處理軟件中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行3次，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2　結(jié)果與分析

2.1超高壓處理壓力對(duì)菌落總數(shù)和大腸菌群的影響

在超高壓對(duì)牡蠣肉滅菌的過(guò)程中，處理壓力是影響滅菌效果的重要因素。確定保壓時(shí)間為10m in，超高壓處理溫度30℃，取樣分析牡蠣肉的菌落總數(shù)和大腸菌群，探討處理壓力對(duì)滅菌效果的影響。

圖1　超高壓處理對(duì)菌落總數(shù)和大腸菌群的影響Fig.1　Relationship between the pressure and total bacteria and Coliforms

大腸菌群是革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞壁較薄，肽聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，脂類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，當(dāng)受到超高壓作用時(shí)，細(xì)胞壁受到機(jī)械損傷更容易，所以細(xì)胞更容易死亡，因此，超高壓加工處理對(duì)大腸菌群的殺滅效果十分顯著。

從圖1中可以看出，相同處理溫度和保壓時(shí)間下，隨著處理壓力的增加，菌落總數(shù)明顯降低，壓力達(dá)到300MPa時(shí)，菌落總數(shù)從3.2718lg cfu/g降低到2.77542lg cfu/g，即殺菌率達(dá)到68.13%，這主要是因?yàn)楦邏菏辜?xì)胞膜、細(xì)胞壁都發(fā)生變化進(jìn)而達(dá)到殺滅微生物的目的；當(dāng)處理壓力達(dá)到500MPa時(shí)，殺菌率達(dá)75.08%。處理壓力從300～500MPa時(shí)殺菌率只增加了7%。超高壓處理后牡蠣肉的大腸菌群均為零。這與張曉敏［15］的研究結(jié)果相符。

參照《國(guó)家海水貝類衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2744-1996）和貝類凈化技術(shù)規(guī)范（SC/T 3013-2002，中華人民共和國(guó)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)），貝類衛(wèi)生指標(biāo)分別是菌落總數(shù)＜5×105cfu/g，大腸菌群＜300MPN/100g。通過(guò)預(yù)處理后牡蠣肉的大腸菌群僅為7MPN/100g，從圖1中可看出，大腸菌群對(duì)壓力及其敏感，在200MPa處理10min就可殺滅全部大腸菌群。這個(gè)結(jié)果與上述標(biāo)準(zhǔn)的要求是十分吻合的。綜合考慮加工處理成本和設(shè)備的安全性，所以，處理壓力選擇300MPa。

2.2保壓時(shí)間對(duì)菌落總數(shù)和大腸菌群的影響

確定處理壓力為300MPa，處理溫度30℃，取樣分析牡蠣肉的菌落總數(shù)和大腸菌群，探討保壓時(shí)間對(duì)滅菌效果的影響。

圖2　超高壓處理保壓時(shí)間對(duì)菌落總數(shù)的影響Fig.2　Relationship between the pressure time and total bacteria

從圖2可以看出，在相同處理溫度和壓力條件下，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落總數(shù)逐漸降低。300MPa處理保壓時(shí)間達(dá)到20min時(shí)，菌落總數(shù)從3.2718lg cfu/g降低到2.49554lg cfu/g，殺菌率達(dá)到83.26%；保壓時(shí)間增加到30min時(shí)，殺菌率可達(dá)到84.60%。保壓時(shí)間從20m in增加到30m in殺菌率只增加了1.34%；超高壓處理后牡蠣肉的大腸菌群均為零；綜合考慮加工處理成本，保壓處理時(shí)間選擇20m in。

2.3處理溫度對(duì)菌落總數(shù)和大腸菌群的影響

預(yù)先將超高壓處理的水介質(zhì)和真空包裝的牡蠣肉加熱到不同的實(shí)驗(yàn)溫度后再進(jìn)行超高壓處理。確定處理?xiàng)l件為壓力為300MPa，保壓時(shí)間10m in，取樣分析牡蠣肉的菌落總數(shù)和大腸菌群，探討處理溫度對(duì)滅菌效果的影響。

圖3　超高壓處理溫度與菌落總數(shù)的關(guān)系Fig.3　Relationship between the temperature and total bacteria

從圖3可以看出，在相同處理壓力和保壓時(shí)間條件下，隨著處理溫度的提高，菌落總數(shù)迅速降低，超高壓處理后牡蠣肉的大腸菌群均為零。當(dāng)溫度提高到30℃時(shí)，菌落總數(shù)從3.2718lg cfu/g降低到2.77542lg cfu/g，殺菌率已達(dá)到68.13%；當(dāng)溫度提高到40℃以上時(shí)，由于超高壓和蛋白質(zhì)加熱變性的雙重疊加效應(yīng)，殺菌率可達(dá)到69.47%；但是牡蠣的口感、色澤和風(fēng)味已經(jīng)有了較明顯變化。綜合考慮加工處理成本和產(chǎn)品品質(zhì)，所以，選擇處理溫度為30℃。

2.4Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表1采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)確定人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化需要輸入的訓(xùn)練數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Experimental design and results

2.5神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)情況，選擇“K折疊”交叉驗(yàn)證的方法擬合相應(yīng)目標(biāo)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，在經(jīng)過(guò)多次神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練后，確定采用3×3×1結(jié)構(gòu)的三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖4，即3個(gè)輸入神經(jīng)元，分別代表壓力（X1）、保壓時(shí)間（X2）和貯藏溫度（X3）；3個(gè)隱含層神經(jīng)元；1個(gè)輸出神經(jīng)元，代表實(shí)驗(yàn)指標(biāo)菌落總數(shù)（Y）。設(shè)置各參數(shù)值，隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)3，過(guò)擬合罰項(xiàng)0.001，歷程數(shù)16，最大迭代數(shù)50，收斂準(zhǔn)則0.00001，執(zhí)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的擬合迭代過(guò)程，擬合決定系數(shù)R2值為0.99985，說(shuō)明3× 3×1結(jié)構(gòu)的三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。

圖4　神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖Fig.4　Structure of artificial neural network（ANN）

2.6神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的優(yōu)化與分析

為了研究X1、X2、X33個(gè)條件對(duì)菌落總數(shù)Y1的影響，先固定其中的1個(gè)因素為0水平，利用JMP 7.0軟件中的曲面刻畫器作三維曲面圖，然后對(duì)其進(jìn)行正投影處理，結(jié)果見(jiàn)圖5。

有研究表明，高壓可以引起細(xì)胞形狀、細(xì)胞膜及細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能的變化，細(xì)胞膜的變化可能是壓力引起微生物死亡最主要的原因之一。

從圖5（a、b）可以看出，壓力在100～300MPa時(shí)，隨著壓力的升高滅菌效果越明顯。在壓力接近500MPa時(shí)，滅菌效果趨于平緩。這是由于在壓力作用下，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，使得發(fā)生功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物流失，氨基酸攝取受阻［12］。阻遏了細(xì)胞的新陳代謝過(guò)程，細(xì)胞分裂減慢，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)滯后，甚至停止。超高壓也可使細(xì)胞壁遭到不同程度的破壞［13］。壓力能夠使微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成受到抑制，酶發(fā)生變性，同時(shí)使脂膜流動(dòng)性降低，進(jìn)而殺滅微生物［14］。同時(shí)超高壓影響DNA復(fù)制，壓力直接影響著微生物的遺傳與變異，影響基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成，這些都是導(dǎo)致壓力的增大，超高壓滅菌效果越好的原因。

從圖5（a、c）可以看出，在相同壓力條件下，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)，同樣可以使菌落總數(shù)有明顯的降低趨勢(shì)。

從圖5（b、c）可以看出，隨著處理溫度的提高，菌落總數(shù)呈下降趨勢(shì)。加熱使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)受熱凝固，失去新陳代謝的能力。同時(shí)高溫能夠使酶失活，進(jìn)而達(dá)到殺滅微生物的目的。

圖5　壓力、保壓時(shí)間和處理溫度對(duì)殺菌效果的影響Fig.5　Effectof pressure，time and time on bacteria inactivation

以上分析可知，壓力對(duì)超高壓殺菌效果的影響最大，保壓時(shí)間和處理溫度次之。在尋求超高壓較好殺菌工藝參數(shù)時(shí)，既要考慮殺菌效果，又要考慮設(shè)備的運(yùn)行成本。因此，本研究以菌落總數(shù)為指標(biāo)，借助JMP7.0軟件的預(yù)測(cè)刻畫器對(duì)超高壓殺菌工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)刻畫圖Fig.6　Prediction plotof the neural network

由圖6可知，當(dāng)壓力接近350MPa時(shí)，保壓時(shí)間接近20m in，處理溫度30℃時(shí)，滅菌效果提升并不明顯，這是由于超高壓已發(fā)揮最大作用?？紤]到運(yùn)行成本，所以選擇350MPa，保壓時(shí)間為20m in，處理溫度30℃，即能達(dá)到最好的殺菌效果（殺菌率85.13%）。這與張曉敏和Lopez-Caballero M的研究結(jié)果接近［15-17］。

2.7神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型是否符合實(shí)際情況，利用建立好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后與實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較和檢驗(yàn)（處理?xiàng)l件為壓力350MPa，保壓時(shí)間20min，處理溫度30℃），以檢驗(yàn)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值的比較Table 3　Comparison of predicted values and experimental values of artificial neural network（ANN）

從表3可知，建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有較好的預(yù)測(cè)能力，能較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)殺菌效果，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)誤差較小，因此可利用該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)整個(gè)超高壓殺菌過(guò)程進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

3　結(jié)論

利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立數(shù)據(jù)集，以菌落總數(shù)（lg cfu/g）為參考標(biāo)準(zhǔn)，借助JMP7.0軟件的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)建立了超高壓對(duì)牡蠣殺菌的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，優(yōu)化的得到最佳處理工藝條件為：壓力350MPa，保壓時(shí)間為20m in，處理溫度30℃，此條件下處理能達(dá)到最好的殺菌效果，即牡蠣肉的菌落總數(shù)為2.44342lg cfu/g（殺菌率達(dá)到85.13%），大腸菌群減少為零。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有較好的預(yù)測(cè)能力，可準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)殺菌效果，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)誤差較?。?.201%）。

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Study on the processing optim ization of ultra high pressure sterilization from oystermeat base on a neuralnetwork method

WANG Xiao-qian，ZHONG Sai-yi，QIN Xiao-m ing*，ZHENG Hui-na，ZHANG Chao-hua
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing（Zhanjiang），College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

The results showed that the best p rocess cond ition was the p ressure was 350MPa for 20m in and the temperature was 30℃，the oystermeat total bacteria after p ressure treatment in this cond ition decreased from 3.2718 to 2.44342lg c fu/g（The sterilization rate was 85.13%），and Coliform s decreased from 7 to 0（MPN/100g）. Validation test results showed that the estab lished neural network model had better p rediction ability which could accurately p red ict the sterilization effec t，and the relative error of p red icted values and experimental values was small（0.201%）.

oyster；ultra high p ressure；sterilization；neuralnetwork

TS254.4

B

1002-0306（2015）06-0257-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.048

2014-07-17

王曉謙（1989-），女，在讀碩士研究生，主要從事海洋生物資源高值化利用方面的研究。

秦小明（1964-），男，博士，教授，主要從事海洋生物資源高值化利用方面的研究。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS-48-07B）；廣東省科技廳（2010B020201014）；國(guó)家星火計(jì)劃十二五重大與重點(diǎn)項(xiàng)目。