響應(yīng)面法優(yōu)化茶葉籽粕中多糖的提取工藝

葉　展，胡傳榮，2，胡晚華，羅　質(zhì)，2，何東平，2，*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.湖北省肽類物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430023）

響應(yīng)面法優(yōu)化茶葉籽粕中多糖的提取工藝

葉展1，胡傳榮1，2，胡晚華1，羅質(zhì)1，2，何東平1，2，*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.湖北省肽類物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430023）

以提取油脂之后的茶葉籽粕為原料，研究從茶葉籽粕中提取茶多糖的工藝，對(duì)提取工藝中液料比、乙醇濃度、浸提時(shí)間和浸提溫度分別進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，以考察各因素對(duì)多糖得率的影響。利用4因素3水平的響應(yīng)面法（RSM）建立二次回歸模型，對(duì)4因素進(jìn)行優(yōu)化組合，同時(shí)對(duì)各因素和因素交互作用進(jìn)行方差分析，從而確定茶葉籽粕提取茶多糖的最佳工藝條件為液料比12∶1、乙醇濃度64%、浸提溫度50℃，浸提時(shí)間1.25h。實(shí)際得率為6.43%。優(yōu)化后工藝茶多糖浸出得率高、安全可靠，可為茶多糖在食品方面的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

茶多糖，茶葉籽粕，提取工藝，優(yōu)化，響應(yīng)面分析

多糖又稱多聚糖（Polysaccharide），是由單糖縮合成的多聚物，廣泛分布于自然界中，是一類重要的活性物質(zhì)。從20世紀(jì)50年代對(duì)真菌多糖抗癌效果的發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們開(kāi)始了對(duì)多糖的化學(xué)、物理、生物學(xué)系列的研究。目前已有報(bào)道的天然多糖化合物約有300多種，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物組織中。近年來(lái)，由于植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、毒副作用小和不易造成殘留等優(yōu)點(diǎn)［1-2］，人們對(duì)植物多糖的研究呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì)［3］。

已有研究表明，茶多糖具有明顯延長(zhǎng)血栓形成時(shí)間，縮短血栓長(zhǎng)度，從而起到抗血栓的藥理作用，此外，茶多糖還具有修復(fù)糖代謝紊亂，降血糖，提高免疫活性，抗腫瘤等多種生理作用［4-5］。我國(guó)是世界主要產(chǎn)茶國(guó)，茶葉籽資源極為豐富。我國(guó)茶葉籽年產(chǎn)量在100萬(wàn)噸以上。取油之后的茶葉籽粕中含有30%～50%的糖類，從茶葉籽粕中提取茶多糖具有重要的實(shí)際意義［6］。

多糖的提取方法主要有水提法、酸堿提取法、復(fù)合酶—熱水浸提法、含水有機(jī)溶劑法等。水提法所得提取物中有一定量的淀粉、蛋白質(zhì)，導(dǎo)致過(guò)濾困難，給后處理帶來(lái)麻煩。酸堿提取法容易破壞多糖的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致其活性喪失。而用甲醇作為提取劑，雖然所得多糖純度較高，但是甲醇具有毒性，其工業(yè)生產(chǎn)受到較大限制。除此之外，還有研究利用發(fā)酵法制備茶多糖［7］，但該工藝技術(shù)不僅較難控制，而且生產(chǎn)周期長(zhǎng)，一般也較少考慮使用。用乙醇浸提，不僅選擇性好、滲透性強(qiáng)、浸出率高、安全，而且更易保留多糖的活性成分［8］。本研究以乙醇作為提取溶劑，從茶葉籽粕中提取茶多糖，為工業(yè)上茶葉籽粕的充分利用和茶多糖的制備提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

茶葉籽粕實(shí)驗(yàn)室自制，原料經(jīng)冷榨，低溫浸提工藝脫脂處理，其組成成分如下：水分9.32%，蛋白質(zhì)42.15%（干基，下同），粗脂肪7.58%，粗纖維5.56%，灰分10.32%；乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚均為分析純?cè)噭?，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密儀器有限公司；FA1104型電子分析天平南京庚辰科學(xué)儀器公司；ZK-82A型真空于燥箱上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；101-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器鞏義市英峪予華儀器廠；TD5A型臺(tái)式離心機(jī)湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1茶多糖的提取工藝路線脫脂茶葉籽粕→水提（多次水提）→漿渣分離→合并上清液→上清液濃縮→乙醇沉淀→離心→沉淀去乙醇→冷凍干燥→粗茶多糖。

1.2.2茶多糖得率測(cè)定茶多糖得率用苯酚硫酸法測(cè)定［9-10］。茶多糖得率的計(jì)算式為：

式中，G—茶多糖得率，%；X—茶多糖純度，%；A—粗茶多糖重，g；M—茶葉籽粕重，g；X的測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［11］。

1.2.3茶多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1液料比對(duì)多糖得率的影響分別準(zhǔn)確稱取10g茶葉籽粕5份，水提之后，取一定量上清液，按比例分別加入3∶1、6∶1、9∶1、12∶1、15∶1濃度為70%的乙醇溶液，于50℃加熱回流1h。棄去乙醇，冷凍干燥測(cè)定糖得率。

1.2.3.2乙醇濃度對(duì)多糖得率的影響前處理方法同上，分別加入90m L濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液于上定量清液中，在50℃水浴加熱回流1h。棄去乙醇，冷凍干燥測(cè)定糖含量。

1.2.3.3浸提溫度對(duì)多糖得率的影響前處理方法同上，加入70%乙醇溶液90m L于定量上清液中，分別在30、40、50、60、70℃的溫度下加熱回流1h。棄去乙醇，冷凍干燥測(cè)定糖得率。

1.2.3.4浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響前處理方法同上，加入50m L 70%乙醇溶液于定量上清液中，在60℃下分別加熱回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h。棄去乙醇，冷凍干燥測(cè)定糖得率。

1.2.4茶多糖提取工藝條件的優(yōu)化經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)探索，研究發(fā)現(xiàn)采用乙醇溶液提取茶葉籽粕中多糖的過(guò)程中，乙醇沉淀時(shí)乙醇的量與茶葉籽粕的液料比、乙醇濃度、浸提溫度和浸提時(shí)間是影響茶多糖得率的主要因素，對(duì)這幾個(gè)因素分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design Expert 8.0.5b數(shù)據(jù)分析軟件，按Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以茶多糖得率作為相應(yīng)函數(shù)，選擇適當(dāng)?shù)囊蛩丶八?，通過(guò)響應(yīng)面分析得出自變量與響應(yīng)函數(shù)之間的統(tǒng)計(jì)模型，確定茶多糖提取的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及編碼Table 1　Code and actual values for variables in Box-Behnken design

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1液料比對(duì)多糖得率的影響液料比對(duì)多糖得率的影響結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，隨著液料比的增加，多糖的得率逐漸增加，液料比達(dá)到12∶1時(shí)，多糖得率趨于穩(wěn)定，由此可知，液料比控制在12∶1左右對(duì)茶多糖的提取較為合適。任健等［12］對(duì)用醇提方法從毛尖茶葉中提取茶多糖進(jìn)行了研究，研究結(jié)果顯示，在料液比為1∶3.5～1∶4范圍內(nèi)，多糖得率達(dá)到最高，每50m L清液中能得到0.033g左右多糖。本實(shí)驗(yàn)中乙醇用量稍多，多糖得率明顯提高，這可能和原料的不同以及乙醇濃度等因素的不同有關(guān)。

圖1　液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.1　Effectof ratio of liquid tomaterial ratio on the yield of polysaccharide

2.1.2乙醇濃度對(duì)多糖得率的影響乙醇濃度對(duì)多糖得率的影響結(jié)果如圖2所示。曲線顯示隨著乙醇濃度的提高，多糖得率會(huì)提高，乙醇濃度達(dá)到60%以上時(shí)，再提高乙醇濃度，多糖得率升高不太明顯，考慮到多糖提取成本，乙醇濃度控制在50%～70%的范圍較適宜。已有的研究顯示［13-14］，乙醇濃度的提高茶多糖得率會(huì)相應(yīng)提高；于淑池等［15］研究了龍井茶多糖的提取工藝，結(jié)果顯示，醇沉濃度為90%時(shí)，茶多糖的提取率最高，為3.413%，而后隨醇沉濃度的增加茶多糖提取率不再升高或者降低。

圖2　乙醇濃度對(duì)多糖得率的影響Fig.2　Effectof ethanol concentration on the yield of polysaccharide

2.1.3浸提溫度對(duì)多糖得率的影響浸提溫度對(duì)多糖得率的影響結(jié)果如圖3所示。從圖3中可知，溫度升高，有利于多糖的提取，溫度超過(guò)50℃后，再繼續(xù)提高溫度，多糖得率有所降低，這可能是由于熱能加快了傳質(zhì)作用，使分子運(yùn)動(dòng)加快，同時(shí)破壞了茶葉籽細(xì)胞組織，有利于多糖的提取。但是，溫度太高對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)有一定影響，它會(huì)導(dǎo)致茶多糖的降解，使多糖得率下降［11，15］。由圖3可知，浸提溫度50℃左右對(duì)多糖提取最為有利。

圖3　浸提溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3　Effectof extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.1.4浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，在上述條件下，浸提時(shí)間對(duì)茶多糖得率的影響不大，從節(jié)約能源的角度考慮，控制浸提時(shí)間在1h左右最佳，但浸提時(shí)間和浸提溫度二者對(duì)多糖得率的綜合作用還必須進(jìn)行考慮。

圖4　浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4　Effectof extraction time on the yield of polysaccharide

表2　響應(yīng)面設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Experimental design and results of response surface analysis

2.2茶多糖提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)B-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［16-17］，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法［18］，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。運(yùn)用Design Expert 8.0.5b數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，回歸系數(shù)R2=0.9667，回歸系數(shù)值在接受范圍之內(nèi)，并且說(shuō)明回歸方程擬合度高，其校正回歸系數(shù)RAdj=0.9878，這表明次模型能解釋98.78%的效應(yīng)值變化，這在實(shí)驗(yàn)允許誤差范圍之內(nèi)，可以有效的分析和預(yù)測(cè)該工藝方法提取茶多糖得率的效果。模型p＜0.01（極顯著），失擬項(xiàng)p=0.0625＞0.05（不顯著），這說(shuō)明模型選擇正確，擬合程度較好，該回歸模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值能較好的吻合［19-20］。B、C、D、AB、AC、AD、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值茶多糖得率的影響極顯著（p＜0.01）。擬合所得的回歸方程如下：

表3　回歸方程模型方差分析Table 3　ANOVA for the response surface quadratic regressionmodel

在所選取的各因素水平范圍之內(nèi)，根據(jù)表3中的F值的大小可以判斷各因素對(duì)茶多糖提取得率的影響強(qiáng)弱。F值越大，影響作用越強(qiáng)。因此，各因素對(duì)茶多糖得率影響程度大小依次為：浸提時(shí)間（D）＞乙醇濃度（B）＞浸提溫度（C）＞液料比（A）。

由Design Expert 8.0.5b軟件處理得到的各因素交互作用的響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖5。從圖5可以直觀地看出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值茶多糖得率的影響。隨著各因素的增大，響應(yīng)值增大；當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小；在交互項(xiàng)對(duì)茶多糖得率的影響中，液料比與浸提時(shí)間的交互作用對(duì)茶多糖得率影響最顯著（p＜0.0001），對(duì)茶多糖影響極顯著的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖5所示。

圖5　兩兩因素交互作用對(duì)茶多糖得率影響的響應(yīng)曲面Fig.5　Response surface of interactive effects for the every two factors on the yield polysaccharide

經(jīng)響應(yīng)面回歸分析得到最佳提取工藝條件為：液料比11.91∶1、乙醇濃度63.77%、浸提溫度50.40℃、浸提時(shí)間1.25h，在此優(yōu)化條件下茶多糖的得率理論值為6.44%，與單因素實(shí)驗(yàn)較為一致，這也進(jìn)一步證實(shí)了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃砸约邦A(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性。為了方便實(shí)際操作，在對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，將最佳工藝條件修正為液料比12∶1、乙醇濃度64%、浸提溫度50℃，浸提時(shí)間1.25h不變。在修正條件下茶多糖得率為：6.43%，這與理論值比較吻合，表明回歸方程模型對(duì)優(yōu)化茶多糖的提取工藝是可行的［21］。

3　結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析對(duì)利用茶葉籽粕制備茶多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并得到了回歸方程。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示該回歸模型非常顯著（p＜0.01），而失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），表明該回歸方程能較好地預(yù)測(cè)茶多糖提取率隨各因素變化的規(guī)律。同時(shí)，由各因素的F值可知，不同提取因素對(duì)茶多糖得率的影響大小依次是：浸提時(shí)間＞乙醇濃度＞浸提溫度＞液料比，在兩兩因素交互作用中，液料比與浸提時(shí)間的交互作用對(duì)茶多糖得率影響最顯著。經(jīng)回歸分析，再結(jié)合實(shí)際操作的方便性進(jìn)行修正，確定茶多糖最佳提取工藝條件為液料比12∶1、乙醇濃度64%、浸提溫度50℃，浸提時(shí)間1.25h不變。在修正條件下茶多糖得率為6.43%，與理論值6.44%較吻合。該工藝的優(yōu)點(diǎn)突出、安全可靠，易保留茶多糖的活性成分，為茶多糖和在食品方面的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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Optim ization of tea polysaccharide extraction from teaseed meal by response surface methodology

YE Zhan1，HU Chuan-rong1，2，HUW an-hua1，LUO Zhi1，2，HE Dong-ping1，2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China；2.Hubei Peptides Engineering and Technology Research Center，Wuhan 430023，China）

Using the deg reased teaseed meal as raw material after oil extraction，the extracting p rocess of tea polysaccharide from the teaseed meal was studied，the experiments were carried out to test the yield of tea polysaccharide affected by different factors which inc lud ing the ratio of liquid to material，concentration of ethanol，extraction time and temperature.Then，the quad ratic reg ression modelwas estab lished by 4-variab le 3-level RSM to op tim ize the four fac tors.At the same time，ANOVA about the different factors and interaction between them was also tested so as to op tim ize extraction technology，The op timal conditions to extract tea polysaccharide from the teaseed mealwere as follows：the ratio of liquid to material 12∶1，the concentration of ethanol64%，the extrac tion tem perature 50℃and the extrac tion time 1.25h，under these conditions，the extraction yield of tea polysaccharide was 6.43%.The tea polysaccharide yield of the op tim ization technology was high，and the technology was safe，reliab le，the technology p rovided the theoretical basis for the development and app lication of tea polysaccharide in food industry.

tea polysaccharide；teaseed meal；extraction p rocess；op tim ization；response surface methodology

TS229

B

1002-0306（2015）06-0230-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.043

2014-06-23

葉展（1989-），男，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

何東平（1957-），男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

國(guó)家公益性科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（201313012-03）。