畢赤酵母不同甲醇利用表型M ut+和M uts表達(dá)FsGLUm基因的比較

楊玉霞，羅艷麗，張慧玲，汪　艷，陳　勇，*，裴建華

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

畢赤酵母不同甲醇利用表型M ut+和M uts表達(dá)FsGLUm基因的比較

楊玉霞1，羅艷麗2，張慧玲1，汪艷1，陳勇1，*，裴建華1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

將來(lái)源于產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的β-葡聚糖酶基因根據(jù)畢赤酵母的偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過(guò)全基因合成該優(yōu)化基因（FsGLUm）并構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-FsGLUm。將pPIC9K-FsGLUm分別用SalⅠ和BglⅡ酶切線性化后電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115染色體DNA中，經(jīng)過(guò)表型篩選和抗性篩選獲得不同甲醇利用表型Mut+和Muts陽(yáng)性菌株。經(jīng)剛果紅平板檢測(cè)，在搖瓶水平下，Mut+型菌株表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生的水解透明圈明顯大于Muts型菌株表達(dá)產(chǎn)物。在發(fā)酵罐水平下，Mut+型菌株各時(shí)間段表達(dá)產(chǎn)物酶活性明顯高于Muts型菌株。Mut+型菌株表達(dá)的酶活性在甲醇誘導(dǎo)96h達(dá)到最大值，為6424U/mL，比活性為2607U/mg，菌體干重為123.6g/L。Muts型菌株表達(dá)的酶活性在誘導(dǎo)后108h達(dá)到最大值，為119U/mL，比活性為1867U/mg，菌體干重為113.5g/L。以上結(jié)果表明，Mut+型畢赤酵母更有利于產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因的表達(dá)。

產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌，β-葡聚糖酶，畢赤酵母，甲醇利用表型

1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73，簡(jiǎn)稱β-葡聚糖酶）在食品、飼料和紡織等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用［1-2］。目前，β-葡聚糖酶主要來(lái)源于可培養(yǎng)的細(xì)菌和真菌［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，在反芻動(dòng)物瘤胃中，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes）產(chǎn)生的β-葡聚糖酶（FsGLU）具有較高的比活性。Shyur等最早利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)FsGLU基因，通過(guò)去除β-葡聚糖酶C端部分氨基酸，其比活性增加了3倍；在90℃保持10m in后，剩余酶活性為初始活性的80%～85%［5］。Wen等則在畢赤酵母X-33中表達(dá)了FsGLU，其活性達(dá)到1940U/m L［6］。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)畢赤酵母對(duì)密碼子的偏愛(ài)性、基因G+C含量以及mRNA折疊自由能對(duì)FsGLU基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，通過(guò)基因合成技術(shù)合成了FsGLUm基因，并構(gòu)建了畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k-FsGLUm，F(xiàn)sGLUm基因在畢赤酵母中獲得了表達(dá)［7］。

外源基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的整合方式有兩種：一種是在His4或5’AOX1 DNA片段的單酶切位點(diǎn)將質(zhì)粒載體切成線性，通過(guò)插入整合進(jìn)入酵母染色體，A0X1基因在表達(dá)時(shí)起主導(dǎo)作用，這樣得到的利用甲醇正常型菌株（Mut+）；另一種酶切質(zhì)粒載體，釋放出包含A0X1末端序列的表達(dá)盒，與宿主染色體上的A0X1基因發(fā)生基因置換，這樣得到的表達(dá)菌株為A0X1缺陷型，它們代謝甲醇的速度明顯減慢，為利用甲醇緩慢型菌株（Muts）［8］。由于不同表型菌株對(duì)甲醇利用速率不同，因此在表達(dá)外源基因的效率有所不同。哪種表型更適合外源基因的表達(dá)，則因不同基因而定。因此，不同的外源基因在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，需進(jìn)行表型篩選，以獲得相應(yīng)基因的高水平表達(dá)菌株。

本研究通過(guò)不同方式將FsGLUm基因整合入酵母細(xì)胞GS115染色體DNA中，并對(duì)酶活性、菌體產(chǎn)量等進(jìn)行比較，以篩選出FsGLUm基因高水平表達(dá)菌株，為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115、分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物所；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶等寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；大麥β-葡聚糖Sigma公司；遺傳霉素G418硫酸鹽北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純；LB、YPD、MM、MD、RDB、BMGY、BMMY培養(yǎng)基參見(jiàn)Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)配制；FM 22和PMT4培養(yǎng)基參見(jiàn)Higgins等的方法配制［9］。

Mycycler PCR儀、Doc XR凝膠成像儀美國(guó)Bio-Rad公司；GeneQuant核酸蛋白檢測(cè)儀美國(guó)Anersham Biosciences公司；ECM 399型電轉(zhuǎn)化儀美國(guó)BTX公司；GUJS-10L型全自動(dòng)發(fā)酵罐鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司；FiveEasy Plus pH儀和PL2002型電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；M ini spin plus離心機(jī)、移液器德國(guó)eppendorf公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因的優(yōu)化和合成在GenBank中檢索出FsGLU基因序列（登錄號(hào)：M 33676）。選取FsGLU成熟肽編碼區(qū)，利用密碼子在線優(yōu)化工具JCat對(duì)該編碼區(qū)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后序列送交上海生工生物有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2β-葡聚糖酶基因酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建FsGLUm基因和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。純化的目的基因和表達(dá)載體采用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α，隨機(jī)挑選候選陽(yáng)性菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1m L菌液送交華大基因用于DNA測(cè)序，將DNA序列正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-FsGLUm。

1.2.3酵母的電擊轉(zhuǎn)化及多拷貝重組子的篩選將構(gòu)建好的載體pPIC9K-FsGLUm分別用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和BglⅡ酶切線性化，以1%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，采用瓊脂糖DNA純化試劑盒回收目的DNA片段備用。取1～5μg目的DNA，以1500V，5ms電擊轉(zhuǎn)化80μL感受態(tài)畢赤酵母GS115后分別涂布于MD和RDB平板上，30℃培養(yǎng)2～4d直至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)于篩選培養(yǎng)基MM和MD平板上，30℃培養(yǎng)2d。在MD與MM板上都正常生長(zhǎng)的為甲醇利用正常型Mut+，在MD上生長(zhǎng)正常而在MM上生長(zhǎng)緩慢的為甲醇利用緩慢型Muts。根據(jù)不同酶切整合方式篩選不同表型轉(zhuǎn)化子，即經(jīng)SalⅠ酶切后獲得的Mut+為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)BglⅡ酶切后獲得的Muts為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別接種于0.5、1、2、4mg/m L G418硫酸鹽的YPD平板進(jìn)行多拷貝重組子篩選［7］。

1.2.4Mut+和Muts重組子的鑒定將上述篩選得到的抗4mg/m LG418硫酸鹽的重組子擴(kuò)大培養(yǎng)，通過(guò)煮-凍-煮的方法提取酵母基因組DNA［10］，以此為DNA模板、5’AOX1/3’AOX1為上下游引物進(jìn)行PCR鑒定。5’AOX1序列為5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC3’，3’AOX1序列為5’GCAAATGGCATTCTGACATCC3’。PCR反應(yīng)體系為ddH2O 11.0μL，10×PCR buffer 2.0μL，dNTP 2.0μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA 3.0μL，Taq DNA聚合酶1.0μL。PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5m in，94℃45s，65℃45s，72℃45s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，72℃最終延伸5m in。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后成像。對(duì)PCR鑒定正確的陽(yáng)性菌落回收并純化其目的DNA PCR產(chǎn)物，送交華大基因以5’AOX1/3’AOX1為上下游引物進(jìn)行DNA雙向測(cè)序。

1.2.5重組酵母在搖瓶及發(fā)酵罐水平的誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.5.1Mut+和Muts重組子在搖瓶水平下的誘導(dǎo)表達(dá)將重組的Mut+型與Muts型酵母菌株分別劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基，28.5℃培養(yǎng)2d。用無(wú)菌牙簽挑取Mut+型與Muts型單菌落分別接種于25m L和500m L BMGY培養(yǎng)基中，250×g，29.5℃，培養(yǎng)至OD600到2～6。將菌液3000×g下離心10m in，棄上清，收集菌體。Mut+和Muts用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，使OD600為1左右。將上述培養(yǎng)基在250×g，29.5℃下培養(yǎng)至96h。每24h添加甲醇，維持終濃度0.5%，并且每24h取樣1m L于-80℃保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)結(jié)束后于12000×g離心5min，分別收集上清和沉淀，用于剛果紅平板定性判斷β-葡聚糖酶的活性。

1.2.5.2Mut+和Muts重組子在發(fā)酵罐水平下的誘導(dǎo)表達(dá)將篩選的Mut+型與Muts型酵母菌株分別劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基，28.5℃培養(yǎng)2d。用無(wú)菌牙簽挑取單克隆于600m L YPD液體培養(yǎng)基中，28.5℃培養(yǎng)至OD600到6。將種子液接種到含有FM 22培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，其他發(fā)酵條件參照Higgins等的方法進(jìn)行［9］。根據(jù)培養(yǎng)基溶解氧濃度控制甲醇的流速，Mut+菌株甲醇流加速率平均為3.0m L/（L·h），Muts菌株甲醇流加速率為1.2m L/（L·h）。在甲醇流加24h后，每12h取10m L樣品，用于測(cè)定酶活性、蛋白質(zhì)含量和菌體質(zhì)量。

1.2.6酶活性、蛋白質(zhì)含量和菌體質(zhì)量的測(cè)定

1.2.6.1剛果紅平板定性鑒定制備含0.5% β-葡聚糖的瓊脂平板，取表達(dá)產(chǎn)物上清液20μL加入平板孔穴中，在37℃下孵育1h，用0.1%的剛果紅溶液染色30m in，再用1mol/L的NaCl脫色30m in。根據(jù)透明圈的大小初步判斷表達(dá)產(chǎn)物酶活性大?。?1］。

1.2.6.2菌體濕重和干重的測(cè)定取1m L發(fā)酵液在1000×g下離心10m in，完全棄去上清后，稱量細(xì)胞重量即為菌體濕重，然后在60℃下烘至恒重，即為菌體干重。

1.2.6.3β-葡聚糖酶活性和比活性的測(cè)定采用DNS法測(cè)定β-葡聚糖酶活性。取適當(dāng)稀釋的酶液200μL，0.8%的大麥葡聚糖200μL（用pH5.0的緩沖液配制），于37℃反應(yīng)5m in，立即加入1m L DNS，振蕩混勻后于95℃水浴顯色5m in，冷卻后加入3.6m L去離子水，振蕩混勻后于540nm處測(cè)定吸光度。定義在pH 5.0、37℃條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位（U）。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用Brad ford法測(cè)定，發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量。比活性（U/mg）=酶活性（U）/蛋白質(zhì)質(zhì)量（mg）。

2　結(jié)果與分析

2.1重組表達(dá)載體pPIC9K-FsGLUm的構(gòu)建與鑒定

將抽提的pPIC9K-FsGLUm質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后產(chǎn)生了1條900bp左右的條帶（圖1），與目的基因的分子大小基本一致，初步證實(shí)目的基因成功插入載體pPIC 9K。重組質(zhì)粒利用5’AOX1/3’AOX1雙向測(cè)序和DNA序列比對(duì)后，確認(rèn)合成目的基因序列無(wú)誤并與pPIC 9K重組成功。

圖1　畢赤酵母表達(dá)酶切質(zhì)粒鑒定Fig.1　Identification of expression plasmids for P.pastoris by restriction endonuclease digestion

2.2Mut+和Muts菌株的篩選

pPIC9K-FsGLUm重組質(zhì)粒分別經(jīng)SalⅠ和BglⅡ線性化后電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115，涂板于相應(yīng)的培養(yǎng)基板上，分別長(zhǎng)出480和132個(gè)表型為HIS+的轉(zhuǎn)化子。將所有轉(zhuǎn)化子在MM與MD板上進(jìn)行表型鑒定發(fā)現(xiàn)，以SalⅠ線性化后轉(zhuǎn)化得到101個(gè)Mut+型菌落，以BglⅡ線性化后轉(zhuǎn)化得到23個(gè)Muts型菌落。再經(jīng)YPD-G418板篩選，抗4mg/m L G418的轉(zhuǎn)化子共有11個(gè)，其中Mut+型菌落9個(gè)，Muts型菌落2個(gè)。

2.3Mut+和Muts菌株的鑒定

酵母染色體DNA經(jīng)PCR和瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，GS115的PCR產(chǎn)物在2.2kb有一條清晰的條帶，為酵母基因組中AOX1條帶。GS115-pPIC9K的PCR產(chǎn)物在2.2kb和0.5kb有兩條清晰的帶，為酵母基因組中AOX1條帶和pPIC 9K中α因子條帶。Mut+型菌株的PCR產(chǎn)物在2.2kb和1.05kb處可見(jiàn)兩條清晰條帶，為酵母基因組中AOX1條帶和pPIC9K-FsGLUm中α因子及目的基因條帶。Muts型菌株的PCR產(chǎn)物只在1.05kb處有一條清晰的條帶，為pPIC9K-FsGLUm中α因子及目的基因條帶（圖2）。以上結(jié)果表明目的基因已經(jīng)成功整合入酵母基因組上，而且Mut+型為單交換整合，Muts型為置換整合。PCR產(chǎn)物DNA測(cè)序進(jìn)一步證明，F(xiàn)sGLUm基因序列正確。

圖2　重組畢赤酵母PCR鑒定Fig.2　Identification of recombinant P.pastoris by PCR

2.4Mut+和Muts菌株表達(dá)β-葡聚糖酶活性的鑒定

從圖3中可以看出，受體酵母菌GS115和轉(zhuǎn)化空表達(dá)載體pPIC9K的酵母菌在培養(yǎng)96h后，培養(yǎng)上清未檢測(cè)到β-葡聚糖酶活性。Mut+型（176號(hào)）和Muts型（611號(hào)）菌株在誘導(dǎo)0h時(shí)均無(wú)β-葡聚糖酶活性。Mut+型菌株在36h和96h時(shí)透明圈直徑分別為19mm和23mm，而Muts型菌株的透明圈直徑僅為8mm和11mm。這表明Mut+型和Muts菌株表達(dá)產(chǎn)物均具有β-葡聚糖酶活性，且酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，Mut+型表達(dá)產(chǎn)物的酶活性高于Muts型菌株。

2.5Mut+和Muts菌株在發(fā)酵罐水平下表達(dá)β-葡聚糖酶的比較

2.5.1Mut+和Muts菌體生長(zhǎng)的比較如圖4所示，在發(fā)酵罐水平條件下，Mut+和Muts菌體濕重及干重均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，Mut+在誘導(dǎo)后96h時(shí)菌體濕重和干重均達(dá)到最大值，為274.6g/L和123.6g/L。而Muts型菌株則在誘導(dǎo)后120h達(dá)到最大值，分別為267.3g/L和113.5g/L。在前108h時(shí)間段，Mut+濕重及干重均高于Muts，在120h時(shí)兩者則基本相同。

圖3　Mut+型和Muts型菌株β-葡聚糖酶的剛果紅平板檢測(cè)Fig.3　Congo-plate test forβ-glucanase activity ofMut+and Mutsstrains

圖4　Mut+和Muts菌體濕重和干重的比較Fig.4　Comparison ofwet and dry cellsweightofMut+and Mutsstrain

2.5.2Mut+和Muts菌株β-葡聚糖酶活性及比活性的比較如圖5和圖6所示，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，Mut+和Muts菌株表達(dá)的β-葡聚糖酶活性和比活性均不斷增加。Mut+型菌株從誘導(dǎo)開(kāi)始酶活性和比活性開(kāi)始增加，在96h時(shí)達(dá)到最大值，分別為6424U/m L和2607U/mg；Muts型菌株則在誘導(dǎo)60h后才開(kāi)始表達(dá)，在108h時(shí)才達(dá)到最大值，分別為119U/m L和1867U/mg。Mut+型菌株最高酶活性及比活性均高于Muts型菌株，Mut+型菌株的酶活性是Muts型菌株的53倍，且Mut+型菌株到達(dá)最高表達(dá)量的時(shí)間早于Muts型菌株。

圖5　Mut+和Muts菌株酶活性變化曲線Fig.5　Change curve of Enzyme activity ofMut+and Mutsstrains

圖6　Mut+和Muts菌株酶比活性變化曲線Fig.6　Change curve of specific activity ofMut+and Mutsstrains

3　討論

巴氏畢赤酵母GS115是一種能利用甲醇作為唯一碳源的微生物。在以甲醇為碳源時(shí)，GS115代償性地大量產(chǎn)生醇氧化酶。在畢赤酵母基因組中有A0X1和A0X2兩種基因編碼醇氧化酶。細(xì)胞中90%醇氧化酶活性由A0X1提供，剩余的10%由A0X 2提供［12］。在本實(shí)驗(yàn)中，以SalⅠ對(duì)pPIC9k-FsGLUm重組載體線性化，載體上His4基因與酵母染色體上His4位點(diǎn)之間發(fā)生單交換事件，結(jié)果FsGLUm基因插入染色體DNA His4位點(diǎn)。由于基因組上A0X1基因被保留，因此細(xì)胞利用甲醇能力正常，在甲醇介質(zhì)上生長(zhǎng)較快，獲得了表達(dá)FsGLUm基因Mut+型菌株。當(dāng)用BglⅡ?qū)PIC9k-FsGLUm線性化時(shí)，載體及基因組中A0X1啟動(dòng)子及3’A0X1區(qū)發(fā)生雙交換事件，F(xiàn)sGLUm基因以交換形式整合到酵母染色體DNA上，AOX 1基因被置換敲除，大部分的醇氧化酶活性喪失，細(xì)胞利用甲醇能力降低，因而細(xì)胞在甲醇介質(zhì)上生長(zhǎng)很慢，即獲得的菌株表型為Muts。無(wú)論是Mut+型菌株還是Muts型菌株，以甘油或葡萄糖為碳源時(shí)二者生長(zhǎng)速度并無(wú)區(qū)別，而以甲醇為碳源時(shí)，Mut+型菌株的生長(zhǎng)顯著快于Muts型菌株［13-14］。

到目前為止，大部分的研究集中在Mut+型菌株上，因?yàn)镸ut+型菌株利用甲醇速度快，因此被認(rèn)為表達(dá)外源蛋白質(zhì)的水平也高。然而，一些研究發(fā)現(xiàn)，Muts型菌株表達(dá)外源蛋白質(zhì)水平優(yōu)于Mut+型菌株。由此看來(lái)，究竟Mut+型菌株還是Muts型菌株更適合外源基因的表達(dá)，還要因具體情況而異。在本研究中Mut+型菌株表達(dá)的FsGLUm活性遠(yuǎn)高于Muts，這主要與A0X的啟動(dòng)子活性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)畢赤酵母以甲醇為唯一碳源時(shí)，A0X1可占細(xì)胞中可溶性蛋白質(zhì)的30%，而A 0X2的活性僅占細(xì)胞中A0X總活性的15%，表明A0X1的啟動(dòng)子pA0X1的活性要明顯強(qiáng)于A0X 2的啟動(dòng)子pA0X2［15］。這也導(dǎo)致Mut+型和Muts型菌株在表達(dá)外外源基因時(shí)表現(xiàn)出不同的特性。

每種表型都有其各自的特點(diǎn)，Muts型菌株在甲醇誘導(dǎo)階段的生長(zhǎng)能力要明顯劣于Mut+型菌株，但是在某些外源蛋白的表達(dá)上既可以消耗較少的甲醇又達(dá)到了較高的表達(dá)水平。而Mut+型菌株則可以適應(yīng)培養(yǎng)基中較高的甲醇濃度，抵抗甲醇毒害的能力也優(yōu)于Muts型菌株［15］。在本研究中，Mut+型酵母菌的前期生長(zhǎng)速度明顯快于Muts型菌株，而到120h時(shí)，二者的菌體質(zhì)量基本相同。這可能與Mut+和Muts型菌株的甲醇利用速度和延遲有關(guān)。在誘導(dǎo)初期，Mut+型菌株利用甲醇速度較快，培養(yǎng)基中的甲醇累積較少，而Muts型菌株利用甲醇較Mut+型菌株慢，培養(yǎng)基中的甲醇濃度可能較高，而影響了宿主菌的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度甲醇易產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物如甲醛和過(guò)氧化氫的累積而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［16］。畢赤酵母對(duì)甲醇利用呈非線性指數(shù)增長(zhǎng)，當(dāng)渡過(guò)延遲期后，宿主細(xì)胞逐漸增加，對(duì)甲醇的利用也相應(yīng)自增加，甲醇累積減少，生長(zhǎng)速度加快。以畢赤酵母表達(dá)美洲商陸抗病毒蛋白基因時(shí)，Mut+型菌株在誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后即有表達(dá)，而Muts型菌株在72h才有微弱表達(dá)，但表達(dá)產(chǎn)物的活性無(wú)顯著差異［14］。

外源基因在Mut+和Muts型菌株中的表達(dá)水平因不同基因而異。張齊等利用畢赤酵母表達(dá)真菌α-淀粉酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，Mut+型菌株的產(chǎn)酶活性一直高于Muts，在發(fā)酵終點(diǎn)Muts型菌株的酶活最終只達(dá)到Mut+型菌株的78.6%［8］。Kim等用重組畢赤酵母表達(dá)Coprinus cinereus過(guò)氧化物酶時(shí)，Mut+型菌株比Muts型菌株的酶活性高3倍，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)速度快2倍［17］。但Barba Cedillo等分別以Muts和Mut+表型的重組子在畢赤酵母中表達(dá)甾醇酯酶，結(jié)果顯示Muts型菌株的比活是Mut+型菌株的2倍［18］。在本研究中，無(wú)論是在搖瓶水平還是發(fā)酵罐水平，Mut+型菌株的酶活性均高于Muts型菌株，Mut+型菌株的最高酶活性是Muts型菌株最高酶活性的53倍，且Mut+型菌株到達(dá)最高表達(dá)量的時(shí)間早于Muts型菌株。導(dǎo)致上述差異的原因之一是外源基因的分子量。有報(bào)道認(rèn)為，Mut+型菌株表達(dá)速率較快，適于小分子蛋白的表達(dá)；盡管Muts型菌株達(dá)到生長(zhǎng)緩慢，最高表達(dá)量的誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，但大分子可正確折疊、加工和修飾，因此更適于大分子的表達(dá)［19］。

流加適宜的碳源是提高外源基因在畢赤酵母中表達(dá)的重要措施之一，特別是對(duì)于Muts型菌株來(lái)說(shuō)，更是如此。甘油、山梨醇、乳酸與甲醇的混合添加均可以提高畢赤酵母表達(dá)堿性果膠酶的產(chǎn)量，其中山梨醇與甲醇的混合流加效果最為顯著。通過(guò)雙碳源混合流加可以提高細(xì)胞活性，增強(qiáng)醇氧化酶活性，提高畢赤酵母表達(dá)外源蛋白效率［20］。在本研究中，流加碳源為甲醇時(shí)，β-葡聚糖酶的活性達(dá)到了6424U/m L。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化流加碳源的組合，琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶在畢赤酵母GS115中的表達(dá)水平可能還有繼續(xù)提高的空間。

4　結(jié)論

產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因在畢赤酵母GS115 Mut+型和Muts型菌株中均得到分泌表達(dá)，Mut+型菌株較Muts型菌株誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間更短，表達(dá)水平更高，更適宜該基因的表達(dá)。

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Evaluation of Mut+and MutsPichia pastoris phenotypes for expression of Fibrobacter succinogenesβ-glucanase gene

YANG Yu-xia1，LUO Yan-li2，ZHANG Hui-ling1，WANG Yan1，CHEN Yong1，*，PEI Jian-hua1
（1.Xinjiang Key Laboratory of Herbivore Nutrition for Meat&Milk Production，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052，China；2.Collage of Grassland and Enviroment Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052，China）

Accord ingto the codon op tim ization of Pichia pastoris，β-g lucanase gene fromFib robacter succinogenes（FsGLUm）was synthesized and the recombinant exp ression vec tor，named pPIC9K-FsGLUm，was constructed.With SalⅠand Bg lⅡ，the pPIC9K-FsGLUm was linearized and theβ-g lucanase gene was electroporated into chromosome DNA of Pichia pastoris GS115.The d ifferent methanol utilization phenotype positive strains，Mut+and Muts，were ob tained after phenotype and resistance screening.In the shake flask level，the halo zones on Congo red p late p roduced by exp ression p roducts of Mut+strain were significantly larger than that of Mutsstrain.In the fermenter level，β-g lucanase activity exp ressed by Mut+strain was significantly higher than those of Mutsstrain in each time period.Enzyme activity，specific enzyme activity，and d ry cellweight of Mut+strain reached the maximum of 6424U/m L，2607U/mg，and 123.6g/L，respectively at 96h aftermethanol induction.While，that of Mutsstrain reached the maximum of 119U/m L，1867U/mg，and 113.5g/L，respectively at 108h after induction.The above results showed that，Mut+strain of Pichia pastoris GS115 was more conducive for exp ression of Fib robacter succinogenesβ-g lucanase gene.

Fibrobac ter succinogenes；β-g lucanase；Pichia pastoris；methanolutilization phenotype

TS201.3

A

1002-0306（2015）06-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.041

2014-06-23

楊玉霞（1988-），女，碩士研究生，研究方向：酶工程。

陳勇（1972-），男，博士，教授，研究方向：酶的基因工程。

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（201191138）；新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展項(xiàng)目（201211104）；自治區(qū)重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)緊缺人才專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（JQRCP32010023）。